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Puntos de nivel PRO 4, Preguntas respondidas: 24, Preguntas formuladas: 15
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Company size
4-9 employees
Year established
1993
Currencies accepted
Argentine pesos (ars), Australian dollars (aud), Canadian dollars (cad), Euro (eur), Pounds sterling (gbp), U. S. dollars (usd)
Muestrario
Muestras de traducción: 1
inglés al español: Aplicaciones de la proteína para cromatografía de exclusión por tamaño con detección múltiple avanzada General field: Medicina Detailed field: Medicina: Farmacia
Texto de origen - inglés Protein Applications for
Advanced Multi-Detector
Size-Exclusion Chromatography
by Mark Pothecary, Stephen Ball, Paul Clarke
Malvern Instruments Ltd, Enigma Business Park, Malvern, Worcestershire, WR14 1XZ
August / September 2012
Figure 1: Schematic of a tetra-detector analytical SEC system.
Figure 2: SEC measurement of IgG showing monomer and dimer molecular weights.
Size-exclusion chromatography (SEC) or gel permeation chromatography (GPC) is frequently used in bioscience laboratories to characterise
purified and recombinant proteins. This technique has also been used to measure molecular weight or to resolve mixtures of monomers,
oligomers and higher order aggregates. Using this method, molecular weight is calculated by creating a calibration curve of standard globular
proteins and comparing the elution time of an unknown to the standards. This is limited in that it is based on a stable relationship between
molecular weight, size, shape or hydrodynamic volume. This relationship varies significantly between proteins introducing unquantifiable
inaccuracies in all measurements made in this way.
Modern analytical systems are capable of
more than just sample detection with a
single concentration detector. The use of
multiple detectors including refractive index
(RI), ultraviolet (UV), light scattering (LS) and
viscometry (IV) allows extensive
characterisation of protein samples in a more
absolute way than was previously possible. RI
and UV both allow accurate concentration
measurements to be made. A combination
of these allows conjugation analyses to be
performed. Light scattering detectors allow
the measurement of molecular weight
without the need for column calibration.
Intrinsic viscosity is a measure of molecular
density and enables structural changes to be
assessed. A combination of light scattering
and intrinsic viscosity allows size (Rh) to be
calculated. This is called tetra detection. A
typical tetra detector analytical SEC system is
shown in the schematic in Figure 1.
This article describes some common
applications for which an advanced
analytical SEC system is used to characterise
proteins beyond the capability of a single
detector system.
Molecular Weight
Individual proteins have a very well
defined molecular weight. Once synthesised
within a cell, and following any postprocessing,
such as cleavage or glycosylation,
a protein’s molecular weight will be fixed with
minimal variation.
Measuring the molecular weight of a novel
protein is interesting in itself. Different proteins
can have significantly different molecular
weights, so measuring the molecular weight of
a purified protein is an excellent way of
confirming that the purified sample contains
the protein of interest. During production of a
recombinant protein, confirming the molecular
weight to be the expected value is a good
indicator that it is being produced correctly by
the host cell line.
Protein Applications for
Advanced Multi-Detector
Size-Exclusion Chromatography
by Mark Pothecary, Stephen Ball, Paul Clarke
Malvern Instruments Ltd, Enigma Business Park, Malvern, Worcestershire, WR14 1XZ
August / September 2012
Figure 1: Schematic of a tetra-detector analytical SEC system.
Figure 2: SEC measurement of IgG showing monomer and dimer molecular weights.
Measuring molecular weight is therefore of
interest both academically and practically as
an indicator of product or sample quality.
Figure 2 shows an example of an antibody
(IgG), a protein commonly used in
biopharmaceutical drugs. Its molecular
weight has been measured as 150 kDa and is
constant across the peak. A very small
secondary peak can also be observed and its
molecular weight has been measured to be
slightly over 300 kDa. The molecular weight
suggests that this small second peak is a
stable dimer present in the sample. With this
knowledge, the dimer can be deemed
acceptable to product quality or purified out
if required.
Oligomerisation State
The activity of any protein is defined by the
final structure or conformation that it takes.
Quaternary structure defines the final
complex formed when multiple protein
chains come together to form a single unit.
This too can be assessed by analytical SEC.
Proteins are individually monodisperse
meaning their molecular weights are stable
across a peak as they elute from a SEC
column. As multiple proteins come
together to form oligomers, the measured
molecular weight will increase discretely
resulting in step changes of molecular weight
within the chromatogram.
In the case of homo-oligomers, when a
number of identical proteins come together,
the measured molecular weight will be a
multiple of the monomer molecular weight
allowing the oligomer number to be
determined via a simple calculation. In
Figure 3 it can be seen that the molecular
weight of BSA increases in steps between
each peak. Each of the molecular weights
corresponds to a multiple of the monomer
molecular weight, in this case, two and three
fold indicating the presence of dimers and
trimers. In the case of the trimer, the slightly
higher than expected molecular weight and
that fact that it is increasing at earlier
retention volumes within the peak suggests
this peak also contains some larger
oligomers. The molecular weight continues
to tail upwards identifying the presence of
some higher order aggregates. The
oligomers, which will have some activity, are
clearly distinguishable from the higher order
aggregates (which will be inactive) by the
stable molecular weights across the peak.
The proportion of each can, of course, be
individually measured by the RI or UV
detector to determine the overall
composition of the oligomer mixture.
Aggregate Quantification
Protein aggregation is a common result of
many sample treatments, prolonged storage
or freeze/thaw action. The structure of a
protein is held together by Van der Waals
forces, hydrogen bonds and hydrophobic
interactions. Changing conditions can
disrupt the delicate balance that holds the
structure together to reveal buried regions of
the polypeptide chain. These regions can
interact with those on other proteins to form
larger complexes of misfolded proteins.
Hydrophobic regions are especially
susceptible to this effect. Aggregates are
often strongly held together by these
forces meaning that their formation is
irreversible and that they continue to grow.
The activity of the proteins will be lost and
they may reach the point when they are no
longer soluble.
Protein aggregates tend to have a very high
molecular weight and are often very
polydisperse, as the complexes formed are
very unlikely to become stable structures of
predictable sizes.
In SEC, aggregate peaks can sometimes
appear in the void volume of the column as
Figure 3: The molecular weight of each peak has been measured in this BSA sample. The molecular weights correspond to the
monomer and dimer. The molecular weight of the third peak is slightly above that of the trimer suggesting it contains this as
well as higher order oligomers.
Figure 4: The light scattering detector clearly identifies the high molecular weight aggregate while the concentration detector,
in this case RI, can be used to calculate the proportion of the sample making up this material.
they are too large to penetrate any of the
pores in the packing material. Their
molecular weight may have limited meaning
given their high polydispersity but it can,
nevertheless, be measured along with their
concentration using refractive index or UV.
The relative sensitivity of light scattering and
concentration detectors means that in the
case of very small amounts of very high
molecular weight material, the concentration
may be below the limit of the concentration
detector, in which case the light scattering
effectively acts as a ‘first responder’ to the
formation of aggregates. If their
concentration is high enough, then their
concentration can be measured. Figure 4
shows a sample of pepsin with a small
amount of aggregated material. It’s large
molecular weight and high polydispersity are
typical of aggregated proteins. The small RI
peak allows the concentration to be
determined as a proportion of the total
material and is seen to make up 0.6% of the
sample. In this particular sample, some lower
molecular weight material has also been
identified, making up 36% of the sample
Figure 5: Intrinsic viscosity for anylate cyclase toxin changes dramatically in the presence and absence of calcium
Size and structural information
Intrinsic viscosity is inversely proportional to
molecular density (or partial specific volume).
This can be measured by a viscometer. A
combination of this and the molecular weight
data from light scattering also allow a
molecular size to be determined. These two
values are very useful for assessing structural
changes between samples. A change in size
and intrinsic viscosity with a constant
molecular weight is a clear indication of a
change in structure and, from an increase or
decrease in density, an idea of the structural
change can be reached.
For proteins, structure determines function
and changes in or loss of structure result in
changes in or loss of activity. Proteins will
change their conformation under different
conditions and this can be assessed using
this technique. Figure 5 shows adenylate
cyclase toxin which changes its size and
intrinsic viscosity (IV or ή) significantly with a
constant molecular weight in the presence or
absence of calcium. In the absence of
calcium ions, the protein is unfolded with
high IV and a larger size. Upon addition of
calcium, the protein assumes its native
conformation with a smaller size and a
considerably lower IV. It is worth noting that
the change in IV is much greater than the
change in size showing its higher sensitivity
to these changes.
Protein conjugates
When two different materials are eluting
from a column, combining two concentration
detectors, in this case, RI and UV, allows the
concentration of each component to be
measured at the same time if the response
factors of each detector to each component
is known. For RI and UV, these response
factors are the dn/dc and the dA/dc. This is
particularly interesting for conjugated
proteins where it is useful to know how
much of a second material (e.g. membrane
lipids or PEG) is conjugated with the protein
of interest.
Studies of membrane proteins are becoming
increasingly frequent in molecular biology
research. Crystallisation is one of the main
goals of this research in order to characterise
the structure of a protein, However,
crystallisation of these proteins has proven
difficult. Crystallisation of a membrane
protein can depend on many factors such as
protein purity and the detergent
concentration or type; removal of too much
of the detergent component of a membrane
Figure 6: Derived chromatogram showing the calculated concentration of protein and detergent.
protein complex can lead to degradation of
the protein and reduce the likelihood of
crystallisation. Characterising and optimising
the proportion of protein and detergent in a
purified membrane protein sample can
provide valuable insight into the likelihood of
crystallisation and the protein content of the
protein detergent complex (PDC).
Figure 6 shows a derived chromatogram
from a study of a membrane protein which
has been purified in the presence of
detergent lipids acting as a surrogate
membrane for the protein to bind to. The
derived chromatogram shows the calculated
protein and detergent concentrations which
have been calculated using a combination of
the RI and UV detectors. From the analysis,
the mass of the complex, protein and
detergent can all be calculated identifying
the protein as a monomer conjugated with
detergent. As can be seen in the figure,
there is also a large excess of free detergent.
Conclusion
Analytical SEC has undergone significant
development since its inception. While
measurements of molecular weight and
purification were the original goals of the
technique, analytical measurements can now
be performed in a more direct way.
Furthermore, concurrent measurements of
concentration, intrinsic viscosity, size and
conjugation can also be performed making
advanced analytical SEC an invaluable tool
for many bioscience laboratories. In
combination, these techniques turn SEC into
a very powerful tool for the characterisation
of protein samples.
Traducción - español
Aplicaciones de la proteína para cromatografía de exclusión por tamaño con detección múltiple avanzada
por Mark Pothecary, Stephen Ball, Paul Clarke
Malvern Instruments Ltd, Enigma Business Park, Malvern, Worcestershire, WR14 1XZ
Agosto / Septiembre 2012
Figura 1: Esquema de un sistema SEC analítico con tetra detector (detector tetra)
Figura 2: Medición SEC de IgG con pesos moleculares de monómero y dímero.
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o la cromatografía de permeación en gel (GPC) son procedimiento frecuentemente utilizados en los laboratorios de biociencia para caracterizar proteínas purificadas y recombinantes. Esta técnica también fue utilizada para medir el peso molecular o para resolver mezclas de monómeros, oligómeros y agregados de orden más elevado. Con la utilización de este método, el peso molecular se calcula creando una curva de calibración de proteínas globulares estándar y luego se compara el tiempo de elución con los estándares. El método es limitado porque se basa en una relación estable entre peso molecular, tamaño, forma o volumen hidrodinámico. Esta relación varía significativamente entre proteínas al introducir inexactitudes no cuantificables en todas las mediciones realizadas de esta forma.
Los sistemas analíticos modernos pueden hacer mucho más que una detección de muestra con un detector de concentración simple. Con los detectores múltiples, que incluyen el de índice de refracción (RI), ultravioleta (UV), dispersión de luz (LS) y viscometría (IV) es posible realizar la caracterización extensiva de las muestras de proteínas de una forma más absoluta que en el pasado. Con los detectores de RI y de UV se pueden obtener las mediciones de concentración exactas. Su uso combinado permite realizar análisis de conjugación. Para medir el peso molecular sin tener que recurrir a la calibración de columna puede utilizar los detectores de luz dispersa. La viscosidad intrínseca es una medida de la densidad molecular y posibilita la evaluación de cambios estructurales. Para calcular el tamaño (RH) se combinan la dispersión de luz y la viscosidad intrínseca. A este procedimiento se lo denomina tetra detección. En la figura 1, se observa un esquema de un tetra detector típico del sistema analítico SEC. Este artículo describe algunas aplicaciones comunes del sistema analítico SEC avanzado en la caracterización de proteínas, que supera la capacidad de un sistema de detector simple.
Peso molecular
Las proteínas individuales tienen un peso molecular muy bien definido. Una vez sintetizadas dentro de una célula, y tras cualquier procesamiento posterior, como la escisión de proteínas y la glucosilación, se podrá determinar el peso molecular de la proteína con una variación mínima. La medición del peso molecular de una proteína nueva es interesante en sí misma.
Las proteínas pueden tener pesos moleculares significativamente diferentes, por lo tanto medir el peso molecular de una proteína purificada es una forma excelente de confirmar que la muestra purificada contiene la proteína que buscamos. La confirmación de que el peso molecular es el esperado es un buen indicador de que la línea celular huésped está realizando la producción de una proteína recombinante de manera correcta.
Figura 1. Esquema de un sistema SEC analítico tetra detector
Solvente Desgasificador al vacío Bomba GPC Transmisor de muestra
Lazo de Inyección
Horno de columna y Columnas
Detector de PDA o UV Detector de LS Detector de RI Detector de viscosímetro Residuos
Figura 2. Medición SEC de lgG que muestra los pesos moleculares de dímero y monómero
Por lo tanto, la medición del peso molecular es importante desde el punto de vista académico y desde el punto de vista práctico como indicador de la calidad de la muestra o el producto. La Figura 2 muestra un ejemplo de un anticuerpo (lgG), una proteína comúnmente utilizada en drogas biofarmacéuticas. Su peso molecular es 150kDa y es una constante a lo largo del pico. También se observa un muy pequeño pico secundario y su peso molecular resultó ser apenas superior a 300kDa. El peso molecular sugiere que este pequeño segundo pico es un dímero estable presente en la muestra. Con esta información, el dímero puede considerarse aceptable para la calidad del producto o ser sometido a purificación de ser necesario.
Estado de oligomerización
La actividad de las proteínas se define por la estructura final o conformación que logra. La estructura cuaternaria define el complejo final que se forma cuando las cadenas de proteína múltiple se juntan y forman una unidad simple. El SEC analítico también puede evaluar ese proceso.
Las proteínas son monodispersas a nivel individual, y esto significa que sus pesos moleculares son estables a lo largo del pico ya que eluyen a partir de una columna de SEC. A medida que las proteínas múltiples se juntan y forman oligómeros, el peso molecular presenta un aumento discreto que resulta en cambios del peso molecular en el marco del cromatograma.
En el caso de los homo oligómeros, cuando una cierta cantidad de proteínas idénticas se juntan, el peso molecular será un múltiplo del peso molecular del monómero, y de esa forma el número del olígomero puede obtenerse con un cálculo simple. En la Figura 3 se observa que el peso molecular del BSA aumenta de un pico a otro. Cada uno de los pesos moleculares corresponde a un múltiplo del peso molecular del monómero; en este caso es hasta dos y tres veces, y esto indica la presencia de dímeros y trímeros.
En el caso del trímero, su peso molecular un poco más alto del esperado y el crecimiento a volúmenes de retención más rápidos dentro del pico, sugieren que este pico también contiene oligómeros más grandes. El peso molecular continúa en ascenso e identifica la presencia de algunos agregados mayores. Los oligómeros, que tienen algo de actividad, se distinguen claramente de los agregados mayores (que estarán inactivos) por los pesos moleculares estables a lo largo del pico. Por supuesto, con el detector RI o UV se puede medir la proporción de cada uno de manera individual para poder determinar la composición general de la mezcla de oligómero.
Cuantificación de agregado
El agregado de proteínas es un resultado común de muchos tratamientos de muestra, almacenamiento prolongado o congelamiento. La estructura de la proteína permanece unida como resultado de las fuerzas de Van der Waals, los lazos de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas. Al cambiar las condiciones, el delicado equilibrio que une la estructura puede resultar interrumpido y pueden surgir regiones enterradas en la cadena de polipéptidos. Estas regiones pueden interactuar con aquellas que se encuentran en otras proteínas y formar complejos más grandes de proteínas mal plegadas. Las regiones hidrofóbicas son particularmente susceptibles a este efecto. Estas fuerzas unen a los agregados, y esto significa que su formación es irreversible y que continuarán creciendo. Las proteínas pierden la actividad y pueden llegar a un punto en el que dejan de ser solubles. Los agregados de proteínas tienden a tener un peso molecular muy alto y suelen ser muy polidispersos, debido a que los complejos formados no tienen muchas posibilidades de convertirse en estructuras estables con tamaños predecibles.
En SEC, los picos de agregados pueden aparecer en el volumen en vacío de la columna porque son demasiado grandes como para penetrar a los poros del material de embalaje. Su peso molecular puede tener un significado limitado considerando su elevada polidispersión aunque, sin embargo, es susceptible de medición junto con su concentración si se utiliza el índice refractivo o UV.
Figura 3. En esta muestra BSA se observa la medición del peso molecular de cada pico. Los pesos moleculares corresponden al monómero y dímero. El peso molecular del tercer pico está ligeramente por encima del trímero, y este hecho indica que lo incluye al igual que a otros oligómeros de orden más elevado.
Figura 4. El detector de dispersión de luz identifica con claridad el agregado de peso molecular elevado mientras que el detector de concentración, en este caso RI, puede ser utilizado para calcular la proporción de la muestra que compone este material.
La sensibilidad relativa de la dispersión de luz y los detectores de concentración implican que en el caso de cantidades muy pequeñas de material con peso molecular muy elevado, la concentración puede estar por debajo del límite del detector de concentración, en cuyo caso la dispersión de luz actúa efectivamente como una “primera respuesta” a la formación de agregados. Si su concentración es lo suficientemente elevada significa que puede medirse. En la Figura 4 se observa una muestra de pepsina con una pequeña cantidad de material agregado. Su peso molecular alto y su elevada polidispersión son típicos de las proteínas agregadas. El pico de RI pequeño permite determinar la concentración como una proporción del material total y, como se observa forma el 0.6% de la muestra. En esta muestra particular, también se pudo identificar un poco de material de peso molecular más bajo, que compone el 36% de la muestra.
Tamaño e información estructural
La viscosidad intrínseca es inversamente proporcional a la densidad molecular (o volumen específico parcial). Se la puede medir con un viscosímetro. Con la combinación de este último y los datos del peso molecular obtenidos con la luz dispersa también se puede obtener el tamaño molecular. Estos dos valores son muy útiles para evaluar los cambios estructurales entre las muestras. Un cambio en el tamaño y la viscosidad intrínseca con un peso molecular constante es un indicador claro de un cambio en la estructura y, a partir de un aumento o una disminución en la densidad, se puede tener una idea del cambio estructural.
En el caso de las proteínas, la estructura determina la función y los cambios o la pérdida de estructura resultan en modificaciones o pérdida de la actividad. Las proteínas cambian su conformación al ser sometidas a diferentes condiciones, y para evaluarlo se utiliza esta técnica.
La Figura 5 muestra la toxina adenilato ciclasa que cambia su tamaño y viscosidad intrínseca (IV or ή) de forma significativa con un peso molecular constante en presencia o ausencia de calcio. Ante la falta de iones de calcio, la proteína resulta mal desplegada con un IV elevado y un tamaño más grande. Al agregar calcio, la proteína vuelve a su conformación original con un tamaño más pequeño y un IV bastante más bajo. Es importante mencionar que el cambio en el IV es muy superior al cambio en el tamaño y esto demuestra su sensibilidad mayor a estas modificaciones.
Conjugados de proteína
Si dos materiales diferentes eluyen de una columna y se combinan dos detectores de concentración, en este caso RI y UV, la concentración de cada componente puede medirse de manera simultánea, siempre y cuando se conozcan los factores de respuesta de cada detector a cada componente.
En el caso de RI y UV, estos factores de respuesta son dn/dc y dA/dc. Esto resulta particularmente interesante para las proteínas conjugadas, ya que es de gran utilidad saber qué cantidad de un segundo material (por ejemplo lípidos de membrana o PEG) está conjugada con la proteína correspondiente. Los estudios de las proteínas de membrana son cada vez más frecuentes en la investigación de biología molecular. La cristalización es uno de los objetivos principales de esta investigación para caracterizar la estructura de la proteína. Sin embargo, la cristalización de estas proteínas demostró ser difícil. La cristalización de una proteína de membrana puede depender de muchos factores como la pureza y la concentración o tipo de detergente; si se extrae una cantidad excesiva del componente detergente de un complejo de proteína de membrana puede haber una degradación de la proteína y una reducción en la posibilidad de cristalización.
Cuando se caracteriza y optimiza la proporción de la proteína y el detergente en una muestra de proteína de membrana purificada se obtiene un análisis de gran valor con respecto a la posibilidad de cristalización y al contenido de proteína del complejo detergente-proteína (PDC).
Figura 5. La viscosidad intrínseca de la toxina adenilato ciclasa cambia drásticamente ante la presencia o ausencia de calcio.
Figura 6. Cromatograma derivado con la concentración calculada de proteína y detergente.
La Figura 6 muestra un cromatograma derivado correspondiente a un estudio de una proteína de membrana purificada con lípidos detergentes que actuaron como membrana sustituta a la cual la proteína debía adherirse. El cromatograma derivado muestra la proteína calculada y las concentraciones de detergente que fueron calculadas con una combinación de los detectores RI y UV.
A partir de los análisis se deduce que es posible calcular la masa del complejo, la proteína y el detergente a través de la identificación de la proteína como monómero conjugado con detergente. Como se observa en la figura, también hay una cantidad excesiva de detergente sin utilizar.
Conclusión
El SEC analítico atravesó un desarrollo significativo desde sus comienzos. Aunque los objetivos originales de la técnica eran las mediciones de peso molecular y purificación, en la actualidad pueden llevarse a cabo las mediciones analíticas de forma más directa. Además, las mediciones concurrentes de la concentración, la viscosidad intrínseca, el tamaño y la conjugación también pueden realizarse con la SEC analítica avanzada, una herramienta de valor incalculable para muchos laboratorios de biociencia. La combinación de estas técnicas convierte a la SEC en una herramienta muy potente para la caracterización de muestras de proteínas.
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