This site uses cookies.
Some of these cookies are essential to the operation of the site,
while others help to improve your experience by providing insights into how the site is being used.
For more information, please see the ProZ.com privacy policy.
Freelance translator and/or interpreter, Verified site user
Data security
This person has a SecurePRO™ card. Because this person is not a ProZ.com Plus subscriber, to view his or her SecurePRO™ card you must be a ProZ.com Business member or Plus subscriber.
Affiliations
This person is not affiliated with any business or Blue Board record at ProZ.com.
Services
Translation, Editing/proofreading
Expertise
Specializes in:
Law (general)
Law: Patents, Trademarks, Copyright
Medical: Health Care
Materials (Plastics, Ceramics, etc.)
Medical: Pharmaceuticals
Science (general)
Botany
Genetics
Biology (-tech,-chem,micro-)
Food & Drink
Also works in:
Agriculture
Medical: Dentistry
Engineering (general)
Engineering: Industrial
Medical (general)
More
Less
Rates
All accepted currencies
Euro (eur)
Payment methods accepted
MasterCard, Check
Portfolio
Sample translations submitted: 4
Italian: ARTIFICIAL ANTIBODY POLYPEPTIDES
Source text - Italian ARTIFICIAL ANTIBODY POLYPEPTIDES
The present invention relates generally to the field of the production and selection of binding and catalytic polypeptides by the methods of molecular biology, using both combinatorial chemistry and recombinant DNA. The invention specifically relates to the generation of both nucleic acid and polypeptide libraries derived therefrom encoding the molecular scaffolding of Fibronectin Type III (Fn3) modified in one or more of its loop regions. The invention also relates to the "artificial mini-antibodies" or "monobodies", i.e., the polypeptides comprising an Fn3 scaffold onto which loop regions capable of binding to a variety of different molecular structures (such as antibody binding sites) have been grafted.
BACKGROUND OF THE INVENTION
Antibody Structure
A standard antibody (Ab) is a tetrameric structure consisting of two identical immunoglobulin (Ig) heavy chains and two identical light chains. The heavy and light chains of an Ab consist of different domains. Each light chain has one variable domain (VL) and one constant domain (CL), while each heavy chain has one variable domain (VH) and three or four constant domains (CH) (Alzari et al., 1988). Each domain, consisting of ~110 amino acid residues, is folded into a characteristic β-sandwich structure formed from two β-sheets packed against each other, the immunoglobulin fold. The VH and VL domains each have three complementarity determining regions (CDR1 3) that are loops, or turns, connecting β-strands at one end of the domains (Figures 1A, C). The variable regions of both the light and heavy chains generally contribute to antigen specificity, although the contribution of the individual chains to specificity is not always equal. Antibody molecules have evolved to bind to a large number of molecules by using six randomized loops (CDRs). However, the size of the antibodies and the complexity of six loops represents a major design hurdle if the end result is to be a relatively small peptide ligand.
Translation - Italian POLIPEPTIDI ANTICORPALI ARTIFICIALI
La presente invenzione riguarda in generale il campo della produzione e selezione di polipeptidi di legame e catalitici con metodi di biologia molecolare, con l’uso sia di una chimica combinatoriale che di DNA ricombinante. Nello specifico l’invenzione riguarda la generazione sia di librerie di acido nucleico che di polipeptidi di loro derivazione, codificanti per una struttura di supporto molecolare di fibronettina di tipo III (Fn3) modificata in uno o più delle sue regioni ad ansa. L’invenzione riguarda anche i "mini-anticorpi artificiali", o "monocorpi", ovvero i polipeptidi comprendenti una struttura di supporto di Fn3 su cui sono state innestate regioni ad ansa in grado di legarsi a una varietà di differenti strutture molecolari (come siti di legame anticorpale).
SFONDO DELL'INVENZIONE
Struttura anticorpale
Un anticorpo standard (Ab) è una struttura tetramerica costituita da due identiche catene pesanti e due identiche catene leggere di immunoglobulina (Ig). Le catene pesanti e leggere di un Ab costituiscono domini differenti. Ciascuna catena leggera possiede un dominio variabile (VL) e un dominio costante (CL), mentre ciascuna catena pesante ha un dominio variabile (VH) e tre o quattro domini costanti (CH) (Alzari et al., 1988). Ciascun dominio, costituito da ~110 residui di amminoacido, si ripiega in una caratteristica struttura β a sandwich formata da due foglietti β, giustapposti uno sull’altro, denominata ripiegamento delle immunoglobuline. Ciascuno dei domini VH e VL possiede tre regioni determinanti la complementarietà (CDR1 3), che sono anse o giri, che collegano i filamenti β a un’estremità dei domini (figure 1A, C). In generale, le regioni variabili sia della catena variabile sia di quella leggera contribuiscono alla specificità antigenica, benché non sia sempre equivalente il contributo alla specificità delle singole catene. Sono state sviluppate molecole anticorpali che si legano a un grande numero di molecole con l'uso di sei anse randomizzate (CDR). Tuttavia la dimensione degli anticorpi e la complessità delle sei anse rappresentano un importante ostacolo progettistico se il risultato finale deve essere un ligando peptidico relativamente piccolo.
Italian: COMPOSITION AND METHOD FOR MODULATING DENDRITIC CELL- T CELL INTERACTION
Source text - Italian
[0001] The present invention relates to compositions and their use for reducing the immune response in an animal,
such as a human or another mammal.
[0002] In one embodiment, the invention relates to compositions and their use for reducing the adhesion of dendritic
cells to T cells.
[0003] More specifically, this embodiment of the invention relates to compositions and their use for reducing the
adhesion of C- type lectin receptors on the surface of dendritic cells to the ICAM- receptors on the surface of T cells. By
modulating this adhesion, both dendritic cell- T cell interactions, such as cluster formation and antigen presentation, as
well as for instance primary T cell responses dependant thereon, can be influenced, resulting in a modulation of the
immune response.
[0004] The compositions of the invention can therefore be used to alter immune responses to specific antigens as
well as immune responses caused by disorders of the immune system, such as may occur in auto- immune diseases or
in allergy.
[0005] In a further embodiment, the method of the invention can further be used in the treatment of HIV -infections
and similar disorders of the immune system, as well as to modulate the immune response to grafts or after transplant.
[0006] The invention is based on the surprising discovery that the adhesion of dendritic cells to T cells is mediated by
a C- type lectin receptor on the surface of the dendritic cells. It has also been found that this C- type lectin binds to the
ICAM receptors on the surface of T cells. With the term "ICAM receptor (s)" both the ICAM- 2 and ICAM- 3 receptor are
meant, and in particular the ICAM- 3 receptor.
[0007] The invention is further based on the finding that the inhibition of this C- type lectin receptor on the dendritic
cells by specific antibodies directed against the C- type lectin receptor, can modulate, and more specifically reduce, the
adhesion of T cells to dendritic cells, and can thereby influence the immune response, in particular the initial stages of
the immune response.
[0008] WO 96/23882 describes a murine and human receptor with C- type lectins domains that is abundantly expressed
on the surface of dendritic cells and thymic epithelial cells. The murine receptor -named "DEC- 205"- is described as a
295 kDa protein with an isoelectric point of about 7,5 that contains 10 C- type lectin domains and that is homologous to
the macrophage mannose receptor (MMR).
[0009] WO 96/23882 further describes monoclonal and polyclonal antibodies against DEC- 205. However, these antibodies
were not able to block dendritic cell function. In particular, monoclonal and polyclonal anti- DEC- 205 antibodies
were unable to inhibit the interaction between dendritic cells and helper T cells, both in vitro (as determined by the
inability of anti- DEC- 205 to inhibit allogenic T cell proliferation in a one way mixed leucocyte reaction) and in vivo (as
determined by the inability of anti- DEC- 205 to inhibit an in vivo response, i.e. in a local graft- versus- host (GVH) reaction).
These results suggest that the DEC- 205 receptor is not involved in dendritic cell- T cell interaction (i.e. adhesion) and
that the anti- DEC- 205 antibodies cannot be used to modulate the immune response.
[0010] Curtis et al.. in Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89 (1992), p. 8356-8360, as well as in WO 93/O 1820. describe a
non- CD4 gp 120 receptor isolated and cloned from human placenta tissue. This gp 120 receptor is expressed on
mammalian cells which do not exhibit high levels of CD4, such as placenta, skeleton muscle, brain, neural and mucosal
cells, as well as other tissues and cells including colon, thymus, heart, T cells, B cells and macrophages (but not in the
liver or the kidney). The amino acid sequence of the C- type lectin gp120 receptor disclosed in SEQ ID’s no. 1 and 2 of
WO 93/01820 has a high degree of sequence homology (>98%) with the C- type lectins that are now found to be present
on dendritic cells.
[0011] Curtis and WO 93/01820 further discuss the role this C- type lectin receptor plays in the infection of the aforementioned
cells/ tissues with HIV, i.e. by binding the major HIV envelope glycoprotein gp 120 prior to internalization of
the virion into the cell. It was found that inhibition of the C- type lectin gp120 receptor can reduce or inhibit HIV infection
of these cells/ tissues. As suitable inhibitors, WO 93/01820 discloses mannose carbohydrates, fucose carbohydrates,
plant lectins such as concanavalin A, specific antibiotics such as pradimicin A, and sugars such as N- acetyl- D- glucosamine
and galactose (which however are described as less potent). These compounds and compositions containing
them are used either in vitro or in vivo to inhibit the binding of HIV to the cell surface.
[0012] WO 93/01820 further discloses that binding of HIV to COS- 7 cells can be inhibited by pre- incubation of gp 120
with an anti- gp 120 monoclonal antibody (named "antibody 110.1 "). However, this antibody is not directed against the
C- type lectins, but against the gp120 protein.
[0013] However, neither Curtis nor WO 93/01820 mentions or suggests the presence of such a C- type lectin on
dendritic cells, nor do these references mention or suggest their role in dendritic cell - T cell interaction during the initial
stages of an immune response.
[0014] WO 95/32734 describes FcgRII (CD32) bridging (or crosslinking) compositions and their use in modulating the
immune response to specific antigens. This reference is based upon the finding that the bridging of FcgRII (CD32)
molecules on antigen presenting cells (APCs) impaires the expression of the essential co- stimulatory molecules B7-1/2
EP 1 086 137 B1
4
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(i.e. prevents their up- regulation) and causes thereby impaires the expression of (i.e. causes the down- modulation of)
the adhesion molecule ICAM- 3, with the functional consequence of an impaired capacity of the monocytes to co- stimulate
the activation of antigen- specific T cells (i.e. resulting in the modulation of antigen- specific T cell unresponsiveness).
The bridging agent is chosen from aggregrated human IgG molecules or Fc- fragments thereof; bi- or multivalent monoclonal
antibodies to FcgRII or fragments thereof, or a fusion of two or more humane IgG Fc parts.
[0015] WO 95/32734 is therefore directed towards modulating (i.e. inhibiting) the co- stimulation signal required for T
cell activation (i.e. besides the primary signal of TcR/CD3 interaction), in particular to induce proliferation and maturation
into effector cells. WO 95/32734 is not directed towards modulating dendritic cell - T cell adhesion, nor does it disclose
or suggest either the presence of C- type lectins on (the surface of) dendritic cells or their interaction with the ICAM- 3
receptors on T cells.
[0016] WO 98/02456 discloses a group II human C- type lectin isolated from a stimulated human macrophage library.
WO 98/49306 discloses a group IV C- type lectin present in human pancreatitis- associated protein ("PAP"). WO 98/41633
discloses a group V human C- type lectin isolated from a human tumor clone.
[0017] WO 98/02456, WO 98/49306 and WO 98/41633 further disclose methods for producing antibodies against
these C- type lectins.
[0018] However, none of these references relates to C- type lectins on dendritic cells; the C- type lectins disclosed in
these references differ from the C- type lectins described therein in origin, in biological function, and in structure.
[0019] Dendritic cells (DC) are professional antigen- presenting cells that capture antigens in the peripheral tissues
and migrate via lymph or blood to the T cell area of draining lymph nodes and spleen. Here they present processed
antigens to naive T cells, initiating antigen- specific primary T cell responses.
[0020] Due to their position in the body surface as immunosurveillance cells, it is likely that DC are the first cells
infected with HIV- 1 after mucosal exposure and are therefore implicated to play an important role in the immunopathogenesis
of HIV. It is now generally believed that HIV converts the normal trafficking process of DC to gain entry into
lymph nodes and access to CD4’’ T cells, as was demonstrated in vivo using primary simian immunodeficiency virus
infection of macaque as a model system (Spira et al., 1996) (Joag et al., 1997). Productive infection of DC with HIV- 1
has been reported by several investigators (Granelli- Piperno et al., J Virol 72 (4), 2733-7, 1998) (Blauvelt et al., Nat Med
3 (12), 1369-75. 1997.) and substantial evidence indicates that DC pulsed with HIV- 1 in vitro can induce a vigorous
infection when co- cultured with T cells (Cameron et al., Science 257 (5068), 383-7, 1992). Although it is still unclear
whether a similar scenario occurs in HIV infected individuals, HIV- 1 transmission from DC to T cells could contribute to
the CD4
T cell depletion observed in AIDS. Studying HIV- DC interactions should contribute to the understanding of
early events of HIV infection and will hopefully lead to strategies aimed at blocking early events in transmission. For a
further discussion, reference is also made to WO 95/32734 and WO 96/23882.
[0021] DC are unique in their ability to interact with and activate resting T cells. However, prior to the present invention,
it was largely unknown how DC- T cell contact is initiated and regulated. Herein, the role of ICAM- 3 in DC- T cell interactions
is investigated. It is demonstrated that although DC strongly adhere to ICAM- 3, this adhesion is not mediated by LFA1,
aD or any other integrin. In the search for this novel ICAM- 3 receptor on DC a C- type lectin receptor was cloned,
designated DC- SIGN, that is preferentially expressed by DC. Besides its prominent role in DC- T cell clustering and
initiation of T cell responses we discovered that DC- SIGN is a major HIV- 1 receptor involved in infection of DC and
subsequent HIV- 1 transmission to T cells. Thus HIV- 1 and resting T cells exploit a similar highly expressed receptor to
interact with DC.
[0022] In a first aspect, the invention relates to the use of an antibody that binds to the receptor designated DC- SIGN,
on the surface of a dendritic cell and represented as seq ID NO: 2 or a natural variant or fragment thereof, in the preparation
of a medicament for reducing an immune response in an animal, wherein said antibody inhibits the interaction between
a dendritic cell and a T cell.
[0023] In particular, the antibody may reduce the adhesion between a dendritic cell and a T cell.
[0024] Especially, the antibody may reduce the adhesion between DC- SIGN on the surface of a dendritic cell and an
ICAM receptor on the surface of a T cell.
[0025] The amino acid sequence of one C- type lectin designated DC- SIGN that was found to be involved in the binding
of the dendritic cells to the T- cells is shown in SEQ ID no. 1 and Figure 9. This C- type lection receptor is essentially
similar to to the C- type lectin gp 120 receptor described by Curtis et al. in Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89 (1992), p.
8356-8360 and in WO 93/01820. In particular, it has a high degree of homology (< 98%) to the amino acid sequence
given in SEQ ID no. 1 of WO 93/01820. It is a group II C- type lectin of 404 amino acids; with an apparant Mr of about 44
kDa; and with a first domain (Met 1 to Ala 76) comprising a cytoplasmic amino terminus, a second domain (Ile 77 to Val
249) comprising tandem repeats, and a third domain (Cys 253 to Ala 404) with a high degree of homology to other known
C- type lectins which are type II membrane proteins. Further characterisation is given below.
[0026] In the invention, this C- type lectin on dendritic cells was found to bind to ICAM receptors on the surface of T -cells.
[0027] Accordingly, the compositions of the invention can be used to modulate (i.e. alter and/or modify), and more
specifically inhibit (i.e. reduce and/or down- tune), the interaction (s) between dendritic cells and T cells.
EP 1 086 137 B1
5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
[0028] Such interactions include the adhesion of T- cells to dendritic cells, for instance in dendritic cell - T cell clustering,
T- cell activation and further include all interactions that rely on contact between dendritic cells and T- cells, by which is
meant either direct cell- to- cell contact or close proximity of dendritic cells and T cells.
[0029] Such further interactions include, but are not limited to, processes involved in generating an immune response,
in particular during the initial stages of such a response, such as primary sensitation/ activation of T- lymphocytes, (i.e.
presentation of antigen and/or MHC- bound peptides to T- cells) and co- stimulation of T cells; as well as processes such
as chemical signalling, endocytosis and trans- epithelial transport. For a discussion of dendritic cell- T cell interactions in
general, all of which may be influenced by the compositions of the invention, reference is made to the discussion below
as well as to WO 95/32734 and WO 96/23882.
[0030] The compositions of the invention can therefore be used to influence the immunomodulatory ability of dendritic
cells; to modulate, and in particular reduce, dendritic cell- mediated (primary) T cell responses, and/or generally to
influence, and in particular inhibit, the immune system.
[0031] Some specific applications include preventing or inhibiting immune responses to specific antigens; inducing
tolerance; immunotherapy; immunosuppression, for instance to prevent transplant rejection; the treatment of auto- immune
diseases such as thyroiditis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), multiple sclerosis and
auto- immune diabetes; and the prevention or treatment of allergies.
[0032] The compositions of the invention may also modulate the activation of other receptors on T cells which are
dependant upon the adhesion or close proximity of dendritic cells to T cells. Furthermore, the finding of the invention
that a C- type lectin on dendritic cells binds to the ICAM receptors on T cells may open up new strategies or possibilities
for influencing the interaction between dendritic cells and T cells, and thereby for modulating the immune system in
general.
[0033] Furthermore, the compositions of the invention can be used to prevent or reduce the transfer of matter from
dendritic cells to T cells, such as chemicals, signalling factors such as chemokines and/or interleukines, etc., and in
particular of viral particles such as HIV. In this way, by using the compositions of the invention, not only can the initial
adhesion of NV to dendritic cells be inhibited, but also the spread of HIV infection from dendritic cells to T cells.
[0034] This finding is of particular importance as it is thought that dendritic cells may serve as a "reservoir" of HIV, in
particular during the initial stages of MV infection. The compositions of the invention can therefore not only be used to
prevent HIV infection of dendritic cells, but also to reduce the spread of HIV infection to T cells after the dendritic cells
have been infected, thereby slowing down the disease process.
[0035] Also, it is known that activation of T cells -i.e. in the lymph glands- plays an important role in the development
of AIDS in a HIV- infected patient. It is believed that the compositions of the invention may be used to prevent, inhibit or
at least delay said T- cell activation and thereby slow the onset and/or the progress of the disease.
[0036] Therefore, in a further aspect, the invention further relates to the use of an antibody that binds to the receptor
designated DC- SIGN, on the surface of a dendritic cell and represented as seq ID NO: 2 or a natural variant or fragment
thereof, in the preparation of a medicament for inhibiting the adhesion of HIV surface protein (i.e. gp120) to the surface
of a dendritic cell and thereby the entry of HIV into said dendritic cell.
[0037] Compounds that can be used as inhibitors for the C- type lectins are known per se, including those described
in WO 93/01820 as mentioned above.
[0038] In general, these are compounds that can bind or adhere to (e.g. in a reversible manner), or that can serve as
a ligand for, the C- type lectins, in particular the C- type lectin of SEQ ID no. 1/Figure 9 or natural variants or equivalents
thereof. Examples are mannose carbohydrates such as mannan and D- mannose; fucose carbohydrates such as Lfucose;
plant lectins such as concanavalin A; antibiotics such as pradimicin A; sugars such as N- acetyl- D- glucosamine
and galactose (which however are described as less potent); as well as suitable peptidomimetic compounds and small
drug molecules, which can for instance be identified using phage display techniques. Furthermore, proteins such as
gp120 and analogs or fragments thereof or similar proteins with binding capacity to C- type lectins on dendritic cells may
be used, as well as isolated ICAM- receptors and analogs thereof, including part or fragments thereof. Such parts or
fragments should then still be such that they can bind to the C- type lectins on the surface of dendritic cells.
[0039] However, the use of carbohydrates is usually less desired from a therapeutic point of view, as such they can
be rapidly metabolized in vivo. Also, the use of plant lectins such as concanavalin A and pradimicin antibiotics can have
disadvantages in a therapeutic setting, in particular when treating patients with auto- immune disorders and/or HNinfections.
[0040] One or more physiological tolerable and/or pharmaceutically acceptable compounds may be used, such as
defined in WO 93/01820. For instance, the use of gp120 or derivatives thereof may cause undesired side effects, in
particular on the nervous system (vide WO 93/01820).
[0041] In contrast, according to the invention, an antibody directed against DC- SIGN as present/ expressed on the
surface of a dendritic cell, or a part, Segment or epitope thereof, is used. As used herein, the term antibodies includes
inter alia polyclonal, monoclonal, chimeric and single chain antibodies, as well as fragments (Fab, Fv, Fa) and an Fab
expression library. Furthermore, "humanized" antibodies may be used, for instance as described WO 98/49306.
EP 1 086 137 B1
6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
[0042] Such antibodies against DC- SIGN of the invention can be obtained as described hereinbelow or in any other
manner known per se, such as those described in WO 95/32734, WO 96/23882, WO 98102456, WO 98/41633 and/or
WO 98/49306.
[0043] For instance, polyclonal antibodies can be obtained by immunizing a suitable host such as a goats rabbit,
sheep, rat, pig or mouse with DC- SIGN or an immunogenic portion, fragment or fusion thereof, optionally with the use
of an immunogenic carrier (such as bovine serum albumin or keyhole limpet hemocyanin) and/or an adjuvant such as
Freund’s, saponin, ISCOM’s, aluminium hydroxide or a similar mineral gel, or keyhole limpet hemocyanin or a similar
surface active substance. After an immuneresponse against the DC- SIGN has been raised (usually within 1-7 days),
the antibodies can be isolated from blood or serum taken from the immunized animal in a manner known per se, which
optionally may involve a step of screening for an antibody with desired properties (i.e. specificity) using known immunoassay
techniques, for which reference is againt made to for instance WO 96/23882.
[0044] Monoclonals may be produced using continuous cell lines in culture, including hybridoma and similar techniques,
again essentially as described in the above cited references.
[0045] Fab- fragments such as F (ab) 2 . Fab’ and Fab fragments may be obtained by digestion of an antibody with
pepsin or another protease, reducing disulfide- linkages and treatment with papain and a reducing agent, respectively.
Fab- expression libraries may for instance be obtained by the method of Huse et al., 1989, Science 245: 1275-1281.
[0046] Preferably, a monoclonal antibody against DC- SIGN on dendritic cells is used, more specifically against the
peptide with the amino acid sequence shown in/ encoded for by SEQ ID no’s 1 and 2 and Figure 9, or (an antigenic) part
thereof; and such monoclonals are a further aspect of the invention. Hereinbelow, the invention will be illustrated by
means of two such monoclonals, herein referred to as AZN- D1 and AZN- D2, although similar monoclonals with comparable
specificity for DC- SIGN may also be used.
[0047] In a further aspect, the invention provides a cell line such as a hybridoma that produces antibodies, preferably
monoclonal antibodies, against DC- SIGN on dendritic cells. more specifically against the peptide with the amino acid
sequence shown in/ encoded for by SEQ ID no’s 1 and 2 and Figure 9 or (an antigenic) part thereof. Hybridomas that
produce the abovementioned monoclonals AZN- 1 and AZN- 2 of the invention were deposited on April 8. 1999 with the
European Collection of Cell Cultures under (provisional) EGACC accesion numbers 990400818 and 99040819, respectively.
[0048] The invention also relates to a method for producing an antibody, preferably a monoclonal antibody, against
DC- SIGN on dendritic cells, more specifically against the peptide with the amino acid sequence shown in (or encoded
for) by SEQ ID no’s 1 and 2 and Figure 9 or (an antigenic) part thereof, said method comprising cultivating a cell or a
cell line that produces said antibody and harvesting/ isolating the antibody from the cell culture.
[0049] Neither (monoclonal) antibodies against DC- SIGN on dendritic cells, nor cells or cell lines that produce such
antibodies, have to date been described in the art, and it is envisaged that the novel antibodies of the invention will have
broad applicability (i.e. besides the pharmaceutical/ therapeutic uses disclosed herein). Some of these application -which
form yet another aspect of the invention- will be clear to the skilled person from the disclosure herein.
[0050] For instance, the antibodies of the invention can be used to detect the presence of (and thereby determine the
expression of) DC- SIGN in or on tissues or whole cells, as well as the detect the presence of DC- SIGN in other biological
samples such as cell fragments or in cell preparations. The information thus obtained can then (also) be used to determine
whether the method or compostions of the invention can be applied to such tissues or cells. The antibodies of the
invention could also be used to detect (qualitatively and/or quantitatively), isolate, purify and/or produce dendritic cells,
for instance in/ from biological samples, including biological fluids such as blood, plasma or lymph fluid; tissue samples
or cell samples such as bone marrow, skin tissue, tumor tissues, etc; or cell cultures or cultivating media.
[0051] For instance, the few methods presently available for isolating/ producing dendritic cells from biological samples
- such as the method described in US- A- 5,643,786, comprising leukapherese followed by fluorescence- acnvated cellsorting
- are very cumbersome multi- step procedures that provide only low yields and heterogenous samples. As a
result, the limited availability of dendritic cells has severely hindered research into this important class of cells.
[0052] By using the monoclonals of the invention, dendritic cells could be isolated and produced with high (er) yield
and with high specificity. In such a method, the monoclonals could be used in a manner known per se for the harvesting,
isolation and/or purification of cells from biological fluids using antibodies.
[0053] For instance, the monoclonals could be attached to a column or matrix, to (para) magnetic beads or to a similar
solid support, which could then be contacted with a biological’ sample or culture medium containing dendritic cells. The
cells that do not attach themselves to the carrier are then separated or removed -e.g. by washing after which the dendritic
cells are separated from the carrier and isolated in a manner known per se.
[0054] Also, the monoclonals of the invention could be used to detect/ determine the presence of dendritic (cells and/or
DC- SIGN) and/or the expression of genes coding therefor in biological samples, in which the antibodies could again be
used in a manner known per se for the analytical of antibodies, such as competitive inhibition assays or ELISA- type
immunoassays. For instance, the antibodies could be used in combination with microscopy techiques, cell sorting techniques
including flow- cytometry and FACS, techniques based upon solid supports and/or detectable labels or markers
EP 1 086 137 B1
7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(which can be attached to the antibodies), techniques baed upon (para) magentic beads or any other detection or assay
technique known per se in which antibodies can be used. Such assays and kits for therein - which besides the antibodies
of the invention can contain all further components known per se for antibody- based assays, as well as manuals etc.-
form a further aspect of the invention.
[0055] Thus, the monoclonals of the invention constitute a very useful diagnostic and research tool, for use both in
vitro as well as in vivo. Possible non-limiting fields of application include the study of dendritic cells and their function
and interactions; the study of the immune system; the detection of dendritic cells and/or DC- SIGN in cells, tissues or
biological fluids such as synovial tissue and skin tissue/ skin cells (dermal dendritic cells); as well as the study of the role
denditric cells play in biological processes or disease mechanisms, such as cancer (as dendritic cells are exploited in
vivo in clinical trials to irradicate tumor formation and development) and auto- immune diseases (including for instance
rheumatoid arthitis).
[0056] For a further description of the methods and techniques known per se in which the antibodies of the invention
can be used, reference is made to the general textbooks, such as D.P. Sites, A.I. Terr, T.G. Parslow; "Basic and clinical
immunology", 8th Ed., Prentice- Hall (1994); I. Roitt, J. Brostof, D. Male: "Immunology", 2nd. Ed., Churchill Livingstone
(1994); all incorporated herein by reference. Particular reference is made to the general uses of antibodies and techniques
involved therein as mentioned in sections 2.7 to 2.17 of the general reference work by Janeway- Travers: "Immunobiology,
the immune system in health and disease", Third Edition.
[0057] A composition of the invention may contain two or more of the abovementioned active compounds, or such
compounds may be used in combination. For instance, an anti- DC- SIGN antibody can be formulated with mannose or
fucose carbohydrates, lectins and/or antibiotics such as pridamicin A. whereby a synergistic effect may be obtained.
[0058] The compositions of the invention may also contain or be used in combination with known co- inhibitory compounds,
such as anti- LF3A; as well as other active principles known per se, depending upon the condition to be treated.
For instance, the compositions of the invention may be formulated or used in combination with immunosuppressants
(i.e. for preventing transplant rejection), immunomodulants, antibiotics, auto- antigens or allergens (for instance as described
in WO 95/3234 or WO 96/23882), Tumor Necrosis Factor (TNF), and anti- viral agents such as anti- HIV agents
and CD4 inhibitors including CD4 directed antibodies such as Leu- 3A. whereby again a synergistic effect can be obtained.
[0059] The compositions of the invention can further be formulated using known carriers and/or adjuvantia to provide
a pharmaceutical form known per se, such as a tablet, capsule, powder, freeze dried preparation, solution for injection,
etc., preferably in a unit dosage form. Such pharmaceutical forms, their use and administration (single or multi dosage
form), as well as carriers, excipients, adjuvantia and/or formulants for use therein, are generally known in the art and
are for instance described in WO 93/01820, WO 95/32734, WO 96/23882, WO 98/02456, WO98/41633 and/or WO
98/49306, all incorporated herein by reference. Furthermore, the formulation can be in the form of a liposome, as
described in WO 93/01820.
[0060] Pharmaceutical formulations of antibodies, their administration and use, are generally described in WO
95/32734, WO 96/23882, WO 98/02456, WO 98/41633 and/or WO 98/49306
[0061] The compositions of the invention may further be packaged, for instance in vials, bottles, sachets, blisters, etc.;
optionally with relevant patient information leaflets and/or instructions for use.
[0062] The compositions of the invention may be used for modulating the immune response in an animal, in particular
a human or another mammal, by administering to said animal an antibody that binds or can bind to a DC- SIGN on the
surface of a dendritic cell, preferably in the form of a composition as described above, in an amount sufficient to alter
or modify an immune response.
[0063] The antibody or composition is in particular administered in such an amount that the interaction (s) between
dendritic cells and T cells are altered or modified, more in particular in such an amount that the adhesion of dendritic
cells to T cells is reduced.
[0064] This method can be used for preventing and/or treating disorders of the immune system, as well as to prevent
transplant rejection, as described above.
[0065] The composition of the invention may be used for the prevention or treatment of HIV infections, by administering
to a HIV infected patient or a person at risk of becoming HIV infected, an antibody that can binds or bind to DC- SIGN
on the surface of a dendritic cell, in such an amount that the adhesion of HIV to the dendritic cells, and in particular of
the gp120 envelop protein of HIV to DC- SIGN on the surface of dendritic cells, is inhibited.
[0066] In all the above methods en embodiments, the compounds/ compositions used will be administered in a therapeutically
effective amount, for which term reference is generally made to WO 93/01820, WO 95/32734 and/or WO
96/23882. The administration can be a single dose, but is preferably part of a multidose administration regimen canted
out over one or more days, weeks or months.
[0067] All terms used herein have the normal meaning in the art, for which reference can be made to inter alia the
definitions given in WO 93/01820, WO 95/32734, WO 96/23882, WO 98/02456, WO98/41633 and/or WO 98/49306,
analogously applied.
[0068] Furthermore, although the invention is described herein with respect to the specific 44kDa C- type lectin receptor
EP 1 086 137 B1
8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
designated DC- SIGN disclosed herein, it is not excluded that other, generally similar C- type lectins, including natural
variants of the sequence of SEQ ID no. 1 and Figure 9, may also be present on dendritic cells and/or may be involved
in dendritic cell - T cell interaction. Such variants will usually have a high degree of amino acid homology (more than
80% to more than 90%) with, and/or be functionally equivalent to the specific C- type lectin disclosed herein. Also, any
such receptor will generally display properties similar to those as described herein; in particular that inhibition of this
receptor, either by carbohydrate inhibitors or specific antibodies, will lead to an alteration of dendritic cell/T- cell interaction.
Any such variant receptors should however be distinguished from the C- type lectin receptor disclosed in WO 96/23882,
inhibition of which does not result in inhibition of the interaction of dendritic cells and T- cells.
[0069] The invention will now be further illustrated by means of the Experimental Part given hereinbelow, as well as
the Figures, in which:
- Figures 1A - 1C are graphs showing: spontaneous adhesion of leukocytes to ICAM- 1 and ICAM- 3 (fig. 1A); adhesion
of leukocytes to ICAM- 3 after activation of b2- integrins (fig. 1B); adhesion of DC to ICAM- 3 in the presence of
blocking antibodies (20Pg/ml) against b2- integrins (NKI- L19), b1- integrin (AIIB2), ICAM- 3 (CBR- IC3/1, CBR- IC3/2)
or in the presence of EDTA (5mM) or EGTA (5mM) (fig. 1C).
- Figures 2A - 2C are graphs showing that the antibodies AZN- D1 and AZN- D2 inhibit adhesion of DC to ICAM- 3 and
recognize an antigen that is specifically expressed by DC.
- Figures 3A and 3B show that DC- SIGN is identical to human placenta HIV gp 120 binding C- type lectin, as can be
seen from SDS- PAGE (fig. 3A) and by schematic presentation of DC- SIGN isolated from human DC (3B).
- Figures 4A and 4B show that DC- SIGN, overexpressed in COS7 cells, is recognized by the anti- DC- SIGN antibody
AZN- D 1 and binds to ICAM- 3.
- Figure 5 shows the tissue distribution of DC- SIGN as determined by immunohistochemical analysis of the expression
of DC- SIGN in tonsils (A and B) and lymph node sections (C and D) (OMx100).
- Figures 6A - 6D show that DC- SIGN mediated adhesion of DC to ICAM- 3 is involved in the DC- T- lymphocyte
interaction, as demonstrated by DC- SIGN mediated adhesion of DC to ICAM- 3 (fig. 6A); heterotypic cell clustering
of DC with K562- ICAM- 3 cells (fig. 6B); dynamic cell clustering of DC with resting PBL (fig. 6C); and the role of DC-
SIGN- ICAM- 3 interaction plays in DC- induced T- cell proliferation (fig. 6D).
- Figure 7 shows that DC SIGN is a receptor for HIV- 1 on DC.
- Figure 8 shows that DC SIGN binds to both ICAM- 3 as well as ICAM- 3 expressing K562 cells.
- Figure 9 shows the sequence of DC- SIGN.
Experimental
[0070] Dendritic cells (DC) capture antigens and migrate to secondary lymphoid tissues where they present antigens
to naive T cells. HIV- 1 subverts this unique capacity to gain access to CD4
T cells. In the invention, a DC specific Ctype
lectin was cloned, designated DC- SIGN, that not only binds to ICAM- 2 and/or ICAM- 3 with high affinity but is also
able to bind HIV- 1. Also, anti- DC- SIGN antibodies were developed that not only inhibit transient DC- T cell interactions
and DC induced T cell proliferation but also effectively inhibit HIV- 1 infection of DC. These findings not only have important
consequences for the understanding on CD4- independent HIV entry into DC but also shed new light on the role of DC-
SIGN in initiating primary immune responses.
Example 1: Adhesion of DC to ICAM- 3 is not mediated by integrins
[0071] The role of ICAM- 3 mediated adhesion in first DC- T cell contact was investigated. Exploiting a novel flowcytrometric
adhesion assay involving ICAM- 3- Fc chimera coated fluorescent beads (Geijtenbeek et al.), the capacity of DC,
resting peripheral blood lymphocytes (PBL) and monocytes to bind to this integrin ligand was tested. Immature DC,
obtained after culturing of monocytes for 7 days in the presence of IL- 4 and GM- CSF, strongly bind ICAM- 3 without prior
activation of b2 integrins (72%, Figure 1A). Figure 1 demonstrates that the adhesion of DC to ICAM- 3 is Ca 2
-dependent
and integrin- independent: in Figs. 1A, B and C one representative experiment of at least 3 is shown (SD
Translation - Italian COMPOSIZIONE E METODO PER MODULARE L'INTERAZIONE TRA CELLULE DENDRITICHE E CELLULE T
Descrizione
La presente invenzione riguarda composizioni e il loro uso per ridurre la risposta immune in un animale, come un essere umano o altro mammifero.
In una forma esecutiva, l'invenzione riguarda composizioni e il loro uso per ridurre l'adesione delle cellule dendritiche alle cellule T.
Più nello specifico, questa forma esecutiva dell'invenzione riguarda composizioni e il loro uso per ridurre l'adesione di recettori di lectina tipo C sulla superficie delle cellule dendritiche, ai recettori ICAM sulla superficie delle cellule T. Modulando questa adesione, è possibile influenzare sia le interazioni cellule dendritiche-cellule T, come la formazione di agglomerati e la presentazione dell'antigene, che, ad esempio, le risposte primarie delle cellule T da esse dipendenti, con il risultato di ottenere una modulazione della risposta immune.
Le composizioni dell'invenzione possono dunque essere utilizzate per alterare le risposte immuni a specifici antigeni, nonché le risposte immuni causate da disordini del sistema immune, come possono avvenire nelle malattie autoimmuni o in un'allergia.
In un'ulteriore forma esecutiva, il metodo dell'invenzione può essere ulteriormente usato nel trattamento di infezioni da HIV e di disordini simili del sistema immune, oltre che per modulare la risposta immune ad impianti o la risposta immune post-trapianto.
L'invenzione è basata sulla sorprendente scoperta che l'adesione delle cellule dendritiche alle cellule T è mediata da un recettore di lectina tipo C sulla superficie delle cellule dendritiche. È stato inoltre scoperto che questa lectina tipo C si lega ai recettori ICAM sulla superficie delle cellule T. Con il termine "recettore/i ICAM" si intendono sia il recettore ICAM-2 che il recettore ICAM-3, e in particolare il recettore ICAM-3.
L'invenzione è ulteriormente basata sulla scoperta che l'inibizione di questo recettore di lectina tipo C sulle cellule dendritiche, attraverso specifici anticorpi diretti contro il recettore di lectina tipo C, è in grado di modulare, e più specificatamente di ridurre, l'adesione delle cellule T alle cellule dendritiche, e può dunque influenzare la risposta immune, in particolare le fasi iniziali della risposta immune.
WO 96/23882 descrive un recettore murino e umano con domini di lectine tipo C che è espresso abbondantemente sulla superficie di cellule dendritiche e cellule epiteliali timiche. Il recettore murino - denominato "DEC-205" – è descritto come proteina di 295 kDa con un punto isoelettrico di circa 7,5 che contiene 10 domini di lectina di tipo C, e che risulta omologo al recettore per il mannosio dei macrofagi (MMR, macrophage mannose receptor).
WO 96/23882 inoltre descrive anticorpi monoclonali e policlonali contro DEC-205. Tuttavia, questi anticorpi non erano in grado di bloccare la funzione delle cellule dendritiche. In particolare, gli anticorpi monoclonali e policlonali anti-DEC-205 non erano in grado di inibire l’interazione tra cellule dendritiche e cellule T helper, sia in vitro (come determinato dall’incapacità di anti-DEC-205 di inibire la proliferazione di cellule T allogeniche in una reazione leucocitaria mista), sia in vivo (come determinato dall’incapacità di anti-DEC-205 di inibire una risposta in vivo, ovvero in una reazione locale impianto-contro-ospite (GVH, graft-versus-host)). Questi risultati suggeriscono che il recettore DEC-205 non è coinvolto nell’interazione cellula dendritica - cellula T (ovvero l’adesione) e che gli anticorpi anti-DEC-205 non possono essere usati per modulare la risposta immune.
Curtis et al., in Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89 (1992), pagg. 8356-8360, come pure in WO 93/O 1820, descrivono un recettore di gp 120 non-CD4 isolato e clonato da tessuto di placenta umana. Questo recettore di gp 120 è espresso su cellule di mammifero che non esibiscono alti livelli di CD4, come placenta, muscolo scheletrico, cervello, cellule neurali e mucose, come pure altri tessuti e cellule tra cui colon, timo, cuore, cellule T, cellule B e macrofagi (ma non nel fegato o rene). La sequenza di amminoacidi del recettore di gp120 lectina tipo C, riportata nelle SEQ ID no. 1 e 2 di WO 93/01820, presenta un alto grado di omologia di sequenza (>98%) con la lectina tipo C, ora nota per essere presente sulle cellule dendritiche.
Curtis e WO 93/01820 discutono ulteriormente il ruolo che questo recettore di lectina tipo C ricopre nell’infezione delle cellule/tessuti sopramenzionati da parte di HIV, ovvero andando a legare la glicoproteina maggiore d’involucro di HIV, gp 120, prima dell’internalizzazione del virione nella cellula. È stato trovato che l’inibizione del recettore di gp120 lectina tipo C può ridurre o inibire l’infezione di HIV di tali cellule/tessuti. Come inibitori adatti, WO 93/01820 divulga carboidrati di mannosio, carboidrati di fucosio, lectine vegetali come concanavalina A, antibiotici specifici come pradimicina A, e zuccheri come N-acetil-D-glucosammina e galattosio (che sono comunque descritti come meno potenti). Questi composti e composizioni che li contengono sono usati in vitro o in vivo per inibire il legame di HIV alla superficie della cellula.
WO 93/01820 inoltre descrive che il legame di HIV su cellule COS-7 può essere inibito mediante preincubazione di gp 120 con un anticorpo monoclonale anti-gp 120 (denominato "anticorpo 110.1 "). Questo anticorpo, tuttavia, non è diretto contro le lectine di tipo C, ma contro la proteina gp120.
Tuttavia, né Curtis né WO 93/01820 fanno menzione o suggeriscono la presenza di tale lectina tipo C sulle cellule dendritiche, e tali rimandi non fanno neppure menzione o suggeriscono il suo ruolo nell’interazione cellula dendritica–cellula T durante gli stadi iniziale di una risposta immune.
WO 95/32734 descrive composizioni con legame a ponte (o a legame crociato) di FcγRII (CD32) e il loro uso nella modulazione del sistema immune verso specifici antigeni. Questo rimando si basa sulla scoperta che il legame a ponte di molecole FcγRII (CD32) su cellule presentanti l’antigene (APC, antigen presenting cell) non permette l’espressione di molecole co-stimolatorie essenziali B7-1/2 (ovvero previene la loro sovra-regolazione) e causa quindi l’inadeguata espressione (ovvero la sotto-regolazione) della molecola di adesione ICAM-3, con la conseguenza funzionale di una compromessa capacità dei monociti di co-stimolare l’attivazione di cellule T antigene-specifiche (il che porta, in altri termini, alla modulazione di una mancata responsività delle cellule T antigene-specifiche). L’agente di legame a ponte è selezionato tra molecole IgG umane aggregate o loro frammenti Fc; anticorpi monoclonali bi- o multi-valenti per FcγRII, o loro frammenti, oppure una fusione di due o più porzioni di Fc di IgG umane.
WO 95/32734 è inoltre diretto alla modulazione (ovvero l’inibizione) del segnale di costimolazione richiesto per l’attivazione di cellule T (ovvero oltre al segnale primario dell’interazione TcR/CD3), in particolare per indurre la proliferazione e maturazione in cellule effettrici. WO 95/32734 non è diretto alla modulazione dell’adesione cellula dendritica–cellula T, né descrive o suggerisce la presenza di lectine tipo C su (sulla superficie di) cellule dendritiche o la loro interazione con recettori ICAM-3 sulle cellule T.
WO 98/02456 descrive una lectina tipo C umana di gruppo II, isolata da una libreria di macrofagi umani stimolati. WO 98/49306 descrive una lectina tipo C di gruppo IV C presente nella proteina umana associata alla pancreatite ("PAP, human pancreatitis-associated protein"). WO 98/41633 descrive una lectina tipo C umana di gruppo V, isolata da un clone di tumore umano.
WO 98/02456, WO 98/49306 e WO 98/41633 inoltre descrivono metodi per produrre anticorpi contro queste lectine tipo C.
Tuttavia, nessuno di questi rimandi fa riferimento a lectine tipo C sulle cellule dendritiche; le lectine tipo C descritte in questi rimandi differiscono dalle lectine tipo C descritte in questa sede, in termini di origine, funzione biologica e struttura.
Le cellule dendritiche (DC, dendritic cell) sono cellule presentati l’antigene professionali che catturano antigeni nei tessuti periferici e migrano attraverso la linfa o il sangue verso l’area delle cellule T nei linfonodi di drenaggio e milza. Qui presentano gli antigeni elaborati alle cellule T naïve, innescando risposte primarie antigene-specifiche delle cellule T.
A causa della loro posizione nella superficie corporea in qualità di cellule di immunosorveglianza, è probabile che le DC siano le prime cellule infettate da HIV-1 dopo l'esposizione mucosa e, quindi, che siano coinvolte in un ruolo importante nell'immunopatogenesi di HIV. Attualmente si ritiene generalmente che HIV converta il normale processo di traffico delle DC per ottenere l’ingresso nei linfonodi e accedere alle cellule T CD4'', come è stato dimostrato in vivo usando come sistema modello il virus principale dell’immunodeficienza di scimmia di macaco (Spira et al., 1996)(Joag et al., 1997). Un’infezione produttiva di DC con HIV-1 è stata riportata da numerosi ricercatori (Granelli-Piperno et al., J Virol 72(4), 2733-7, 1998) (Blauvelt et al., Nat Med 3(12), 1369-75. 1997.) e una prova fondata indica che DC stimolate in vitro con HIV-1 possono indurre una vigorosa infezione quando co-coltivate con cellule T (Cameron et al., Science 257(5068), 383-7, 1992). Benché non sia ancora chiaro se un simile scenario insorga negli individui infettati da HIV, la trasmissione di HIV-1 da DC alle cellule T potrebbe contribuire all’impoverimento delle cellule T CD4 osservata nell’AIDS. Lo studio delle interazioni HIV-DC potrebbe contribuire alla comprensione degli eventi precoci dell’infezione da HIV e porterà sperabilmente a strategie dedicate al blocco degli eventi precoci della trasmissione. Per un’ulteriore discussione, è fatto rimando anche ai documenti WO 95/32734 e WO 96/23882.
Le DC sono uniche nella loro capacità di interagire con e attivare le cellule T quiescenti. Tuttavia, prima della presente invenzione, era in gran parte sconosciuto la modalità con cui il contatto DC-cellule T fosse innescato e regolato. Nel presente contesto, è studiato il ruolo di ICAM-3 nelle interazioni DC-cellula T. È stato dimostrato che, benché le DC aderiscano fortemente ad ICAM-3, tale adesione non è mediata da LFA-1, αD o da qualsiasi altra integrina. Nella ricerca di questo nuovo recettore per ICAM-3 sulle DC, è stato clonato un nuovo recettore di lectina tipo C, denominato DC-SIGN, che risulta essere espresso di preferenza sulle DC. Assieme al suo ruolo principale nell’agglomerazione e innesco di DC-cellule T nelle risposte mediate dalle cellule T, abbiamo scoperto che DC-SIGN è un importante recettore di HIV-1 implicato nell’infezione delle DC e nella successiva trasmissione di HIV-1 alle cellule T. Per interagire con le DC, HIV-1 e le cellule T quiescenti adoperano quindi un recettore simile altamente espresso.
In un primo aspetto, l'invenzione riguarda l'uso di un anticorpo che si lega al recettore denominato DC-SIGN sulla superficie di una cellula dendritica, e rappresentato come seq ID NO:2, o di una sua variante o frammento naturale, nella preparazione di un medicinale per ridurre una risposta immune in un animale, in cui detto anticorpo inibisce l'interazione tra una cellula dendritica e una cellula T.
In particolare, l'anticorpo può ridurre l'adesione tra una cellula dendritica e una cellula T.
In special modo, l'anticorpo può ridurre l'adesione tra un DC-SIGN sulla superficie di una cellula dendritica e un recettore ICAM sulla superficie di una cellula T.
La sequenza di amminoacidi di un recettore di lectina tipo C, denominato DC-SIGN, che è stato rilevato essere coinvolto nel legame delle cellule dendritiche alle cellule T, è riportata nella SEQ ID no. 1 e nella figura 9. Questo recettore di lectina tipo C è essenzialmente simile al recettore di gp 120 lectina tipo C descritto da Curtis et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992), p. 8356-8360 e in WO 93/01820. In particolare, esso presenta un alto grado di omologia (< 98%) con la sequenza di amminoacidi fornita nella SEQ ID no.1 di WO 93/01820. Questa è una lectina tipo C di gruppo II di 404 amminoacidi; con un Mr apparante do circa 44 kDa; e con un primo dominio (da Met 1 a Ala 76) comprendente un ammino-terminale citoplasmatico, un secondo dominio (da Ile 77 a Val 249) comprendente ripetizioni in tandem, e un terzo dominio (da Cys 253 ad Ala 404) con un alto grado di omologia con altre lectine tipo C note, che sono proteine di membrana di tipo II. A seguire è fornita un'ulteriore caratterizzazione.
Nell'invenzione è stato scoperto che questa lectina tipo C sulle cellule dendritiche si lega a recettori ICAM sulla superficie delle cellule T.
Pertanto, le composizioni dell'invenzione possono essere utilizzate per modulare (ovvero alterare e/o modificare), e più specificatamente per inibire (ovvero ridurre e/o sottoregolare), la/e interazione/i tra cellule dendritiche e cellule T.
Tali interazioni includono l'adesione di cellule T a cellule dendritiche, ad esempio nell'agglomerazione tra cellule dendritiche e cellule T, nell'attivazione delle cellule T, e comprendono inoltre tutte le interazioni che fanno affidamento sul contatto tra cellule dendritiche e cellule T, con il quale si intende sia un contatto diretto cellula-cellula, sia una stretta prossimità tra cellule dendritiche e cellule T.
Tali interazioni inoltre comprendono, non essendo tuttavia limitate a, processi implicati nella generazione di una risposta immune, in particolare durante gli stadi iniziali di tale risposta, come una sensibilizzazione/attivazione primaria di linfociti T, (ovvero, presentazione alle cellule T dell’antigene e/o di peptidi legati a MHC) e co-stimolazione di cellule T; come pure processi quali la segnalazione chimica, endocitosi e trasporto trans-epiteliale. Per una discussione delle interazioni tra cellula dendritica-cellula T in generale, le quali possono essere tutte influenzate dalle composizioni dell’invenzione, è fatto rimando alla discussione che segue nonché a WO 95/32734 e WO 96/23882.
Le composizioni dell'invenzione possono dunque essere usate per influenzare la capacità immunomodulatoria delle cellule dendritiche; per modulare, e in particolare ridurre, le risposte (primarie) delle cellule T mediate dalle cellule dendritiche, e/o per influenzare in generale, e inibire in particolare, il sistema immune.
Alcune specifiche applicazioni comprendono la prevenzione o inibizione di risposte immuni per specifici antigeni; tra cui la tolleranza; immunoterapia; immunosoppressione, ad esempio per prevenire un rigetto di trapianto; il trattamento di malattie auto-immuni come tiroidite, artrite reumatoide, lupus eritematoso sistemico (SLE, systemic lupus erythematosus), sclerosi multipla e diabete auto-immune; e la prevenzione o trattamento di allergie.
Le composizioni dell'invenzione possono anche modulare l'attivazione di altri recettori su cellule T che dipendono dall'adesione o dalla stretta prossimità delle cellule dendritiche alle cellule T. Inoltre, la scoperta dell’invenzione che una lectina tipo C su cellule dendritiche si lega a recettori ICAM presenti su cellule T, può dare avvio a nuove strategie o possibilità per influenzare l’interazione tra cellule dendritiche e cellule T, e quindi per la modulazione del sistema immune in generale.
Inoltre, le composizioni dell'invenzione possono essere utilizzate per impedire o ridurre il trasferimento di materia dalle cellule dendritiche alle cellule T, come sostanze chimiche, fattori di segnalazione quali chemochine e/o interleuchine, ecc., e in particolare di particelle virali come HIV. In questo modo, usando le composizioni dell'invenzione, non solo è possibile inibire l'adesione iniziale di NV alle cellule dendritiche, ma anche la diffusione dell'infezione HIV dalle cellule dendritiche alle cellule T.
Questa scoperta è di particolare rilevanza, dal momento che si ritiene che le cellule dendritiche possano agire da "serbatoio" per HIV, in particolare durante le fasi iniziali dell'infezione da MV. Le composizioni dell'invenzione possono quindi essere usate non solo per impedire un'infezione da HIV di cellule dendritiche, ma anche per ridurre la diffusione dell'infezione da HIV alle cellule T una volta che le cellule dendritiche sono state infettate, rallentando così il processo patologico.
Inoltre, è noto che l’attivazione delle cellule –ovvero nelle ghiandole linfatiche - ricopre un ruolo nello sviluppo dell’AIDS in un paziente infettato da HIV. Si ritiene che le composizioni dell’invenzione possano essere usate per prevenire, inibire o almeno ritardare detta attivazione delle cellule T, abbassando quindi l’insorgenza e/o il progredire della malattia.
Inoltre, in un ulteriore aspetto, l'invenzione riguarda anche l'uso di un anticorpo che si lega al recettore denominato DC-SIGN sulla superficie di una cellula dendritica, e rappresentato come seq ID NO:2, o di una sua variante o frammento naturale, nella preparazione di un medicinale per inibire l'adesione di una proteina di superficie di HIV (ovvero gp120) alla superficie di una cellula dendritica, e quindi l'ingresso di HIV in detta cellule dendritica.
Composti che possono essere usati come inibitori per le lectine tipo C sono di per sé noti, tra i quali quelli descritti in WO 93/01820, come sopra menzionato.
In generale, questi sono composti che possono legarsi o aderire a (ad esempio in una maniera reversibile) oppure che possono fungere da ligando per le lectine tipo C, in particolare la lectina tipo C della SEQ ID no.1/figura 9 o loro varianti o equivalenti naturali. Esempi sono carboidrati di mannosio come mannano e D-mannosio; carboidrati di fucosio come L-fucosio; lectine vegetali come concanavalina A; antibiotici come pradimicina A; zuccheri come N-acetil-D-glucosammina e galattosio (che, tuttavia, sono descritti come meno potenti); come pure composti peptidomimetici adatti e piccole molecole farmaceutiche, che possono ad esempio essere identificati usando tecniche di visualizzazione su fago. Inoltre, è possibile usare proteine come gp120 e suoi analoghi o frammenti, o proteine simili, dotati di capacità di legame alle lectine tipo C sulle cellule dendritiche, come pure recettori ICAM isolati e suoi analoghi, sue porzioni o frammenti inclusi. Tali porzioni o frammenti dovrebbero essere quindi ancora tali da essere in grado di legarsi alle lectine tipo C sulla superficie di cellule dendritiche.
Tuttavia, l’uso di carboidrati è solitamente meno desiderabile da un punto di vista terapeutico, poiché essi possono essere rapidamente metabolizzati in vivo. Inoltre, l’uso di lectine vegetali, come concanavalina A e antibiotici come pradimicina, possono avere svantaggi in un approccio terapeutico, in particolare quando si trattano pazienti con disordini auto-immuni e/o infezioni HN.
È possibile usare uno o più composti fisiologicamente tollerabili e/o farmaceuticamente accettabili, come delineato in WO 93/01820. Ad esempio, l’uso di gp120 o suoi derivati può causare effetti collaterali indesiderati, in particolare sul sistema nervoso (vedere WO 93/01820).
Per contro, secondo l’invenzione, si usa un anticorpo diretto contro DC-SIGN come presente/espresso sulla superficie di una cellula dendritica, o come sua porzione, segmento o epitopo. Nel presente contesto, il termine anticorpi è usato per comprendere, inter alia, anticorpi policlonali, monoclonali, chimerici e a singola catena, come pure frammenti (Fab, Fv, Fa) e una libreria di espressione di Fab. Inoltre è possibile usare anticorpi "umanizzati", ad esempio come descritto in WO 98/49306.
Tali anticorpi contro DC-SIGN dell’invenzione possono essere ottenuti come descritto a seguire nel presente contesto o in qualsiasi altra maniera di per sé nota, come quelle descritte in WO 95/32734, WO 96/23882, WO 98102456, WO 98/41633 e/o WO 98/49306.
È possibile ad esempio ottenere anticorpi policlonali immunizzando un ospite adatto, come capre, conigli, ratti, maiali o topi, con DC-SIGN o una sua porzione, frammento o fusione immunogenica, opzionalmente con l’uso di un trasportatore immunogenico (come albumina di siero bovino o emocianina di fissurella) e/o un adiuvante come saponina di Freund, ISCOM, idrossido di alluminio, o un simile gel minerale, oppure emocianina di fissurella o una simile sostanza tensioattiva. Dopo avere suscitato una risposta immune contro DC-SIGN (di solito, entro 1-7 giorni), gli anticorpi possono essere isolati da sangue o siero prelevato dall'animale immunizzato in una maniera di per sé nota, che opzionalmente può implicare un passaggio di screening per un anticorpo dotato delle proprietà desiderate (ovvero, una specificità desiderata) usando tecniche note di immunosaggio, per cui si fa ancora riferimento ad esempio a WO 96/23882.
I monoclonali possono essere prodotti usando linee cellulari continue in coltura, comprendenti tecniche di ibridoma e similari, ancora come descritto essenzialmente nei succitati rimandi.
Frammenti Fab, come frammenti F(ab)2. Fab' e Fab, possono essere ottenuti tramite digestione di un anticorpo con pepsina o altra proteasi, riducendo i legami disolfuro e, rispettivamente, mediante trattamento con papaina e un agente riducente. Librerie di espressione di Fab possono ad esempio essere ottenute con il metodo di Huse et al., 1989, Science 245:1275-1281.
Si usa preferibilmente un anticorpo contro DC-SIGN su cellule dendritiche, più specificamente contro il peptide con la sequenza di amminoacidi nota in/codificata dalla SEQ ID no 1 e 2 e nella figura 9, oppure una sua porzione (antigenica); e tali monoclonali come un ulteriore aspetto dell’invenzione. A seguire nel presente contesto, l’invenzione sarà illustrata per mezzo di due di questi monoclonali, nel presente contesto indicati AZN-D1 e AZN-D2, sebbene possano essere anche usati simili monoclonali dotati di specificità paragonabile per DC-SIGN.
In un altro aspetto, l’invenzione fornisce una linea cellulare, come un ibridoma, che produce anticorpi, preferibilmente anticorpi monoclonali, contro DC-SIGN presente su cellule dendritiche, più nello specifico contro il peptide con la sequenza di amminoacidi riportata in/codificata dalle SEQ ID no 1 e 2 e nella figure 9 o una sua porzione (antigenica). Ibridomi che producono i sopramenzionati monoclonali AZN-1 e AZN-2 dell’invenzione, sono stati depositati in data 8 aprile 1999 presso la European Collection of Cell Cultures rispettivamente sotto i numeri d’ingresso (provvisori) EGACC 990400818 e 99040819.
L'invenzione riguarda anche un metodo per produrre un anticorpo, preferibilmente un anticorpo monoclonale, contro DC-SIGN su cellule dendritiche, più nello specifico contro il peptide con la sequenza di amminoacidi mostrata in (codificata dalle) SEQ ID no 1 e 2 e nella figura 9 o una sua porzione (antigenica), detto metodo comprendente i passaggi di coltivare una cellula o una linea cellulare che produce detto anticorpo e raccogliere/isolare l’anticorpo dalla coltura cellulare.
Né gli anticorpi (monoclonali) contro DC-SIGN presente su cellule dendritiche, né cellule o linee cellulari che producono tali anticorpi, sono stati attualmente descritti nel ramo, e si considera che i nuovi anticorpi dell’invenzione avranno un’ampia applicabilità (ovvero, oltre agli usi farmaceutici/terapeutici descritti in questa sede). Alcune di queste applicazioni – che formano ancora un altro aspetto dell’invenzione – risulteranno chiare alla persona esperta dietro lettura della presente descrizione.
Ad esempio, gli anticorpi dell’invenzione possono essere usati per rilevare la presenza (e quindi determinare l’espressione) di DC-SIGN, in o su tessuti o cellule intere, nonché per il rilevamento della presenza di DC-SIGN in altri campioni biologici, come frammenti cellulari o in preparazione cellulari. Le informazioni così ottenute possono quindi (anche) essere usate per determinare se il metodo o le composizioni dell'invenzione possano essere applicate a tali tessuti o cellule. Gli anticorpi dell’invenzione potrebbero anche essere usati per rilevare (per via qualitativa e/o quantitativa), isolare, purificare e/o produrre cellule dendritiche, ad esempio in/da tessuti biologici, tra cui fluidi biologici come sangue, plasma o fluido linfatico; campioni tissutali o campioni cellulari, come midollo osseo, tessuto cutaneo, tessuto tumorale, ecc; oppure colture cellulari o mezzi di coltura.
Ad esempio, i pochi metodi attualmente disponibili per isolare/produrre cellule dendritiche da campioni biologici – un tale metodo è descritto in US-A-5.643.786, comprendente leucoferesi seguita da separazione cellulare attivata per fluorescenza – sono procedure a più passaggi notevolmente disagevoli che forniscono soltanto basse rese e campioni eterogenei. Quindi, la limitata disponibilità di cellule dendritiche ha severamente ostacolato la ricerca in questa classe di cellule.
Usando i monoclonali dell’invenzione, sarebbe possibile isolare e produrre cellule dendritiche con resa elevata e maggiore, e con elevata specificità. In tale metodo, i monoclonali potrebbero essere usati in una maniera di per sé nota per la raccolta, isolamento e/o purificazione di cellule da fluidi biologici con l’uso di anticorpi.
Ad esempio, i monoclonali potrebbero essere fissati a una colonna o matrice, a sferette (para)magnetiche o a un supporto solido simile, che potrebbe essere quindi messo in contatto con un campione biologico o mezzo di coltura contenente cellule dendritiche. Le cellule che non si attaccano al trasportatore sono quindi separate o rimosse - ad esempio con un lavaggio, dopo di che le cellule dendritiche sono separate dal trasportatore e isolate in una maniera di per sé nota.
Inoltre, i monoclonali dell’invenzione potrebbero essere usati per rilevare/determinare la presenza di cellule dendritiche (cellule e/o DC-SIGN) e/o l’espressione di loro geni codificanti in campioni biologici, in cui gli anticorpi potrebbero essere ancora usati in una maniera di per sé nota per analisi che si avvalgono di anticorpi, come saggi di inibizione per competizione o immunosaggi di tipo ELISA. Ad esempio, gli anticorpi potrebbero essere usati in combinazione con tecniche di microscopia, tecniche di separazione cellulare, tra cui citometria di flusso e FACS, tecniche basate su supporti solidi e/o etichette o marcatori rilevabili (che possono essere fissati sugli anticorpi), tecniche basate su sferette (para)magentiche o qualsiasi altra tecnica di rilevamento o saggio di per sé nota, in cui è possibile usare anticorpi. Tali saggi e kit – che oltre agli anticorpi dell’invenzione possono contenere tutti gli ulteriori componenti di per sé noti per i saggi basati su anticorpi, nonché manuali ecc - formano un ulteriore aspetto dell’invenzione.
I monoclonali dell’invenzione costituiscono quindi uno strumento diagnostico e di ricerca molto utile, sia per un uso vitro che in vivo. Campi non limitanti possibili comprendono lo studio di cellule dendritiche e la loro funzione e interazioni; lo studio del sistema immune; il rilevamento di cellule dendritiche e/o DC-SIGN in cellule, tessuti, fluidi biologici, come tessuto sinoviale e tessuto cutaneo/cellule della cute (cellule dendritiche del derma); nonché lo studio del ruolo svolto dalle cellule dendritiche nei processi biologici o meccanismi patologici, quali tumore (cellule dendritiche sono usate infatti in prove cliniche in vivo per eradicare la formazione e lo sviluppo di tumori) e malattie auto-immuni (comprendenti, ad esempio, l’artrite reumatoide).
Per un’ulteriore descrizione dei metodi e tecniche di per sé noti, in cui è possibile usare gli anticorpi dell’invenzione, si rimanda ai testi generali di riferimento come D.P. Sites, A.I. Terr, T.G. Parslow; "Basic and clinical immunology", 8a Ed., Prentice-Hall (1994); I. Roitt, J. Brostof, D. Male: "Immunology", 2a Ed., Churchill Livingstone (1994); tutti incorporati in questa sede tramite rimando. Si fa particolare rimando agli usi generali di anticorpi e tecniche coinvolte in questa sede, come menzionato nelle sezioni da 2.7 a 2.17 del lavoro di riferimento generale di Janeway-Travers: "Immunobiology, the immune system in health and disease", terza edizione.
Una composizione dell’invenzione può contenere due o più dei sopra menzionati composti attivi, oppure tali composti possono essere usati in combinazione. Ad esempio, un anticorpo anti-DC-SIGN può essere formulato con carboidrati di mannosio e fucosio, lectine e/o antibiotici come pridamicina A, attraverso cui è possibile ottenere un effetto sinergico.
Le composizioni dell'invenzione possono anche contenere o essere usate in combinazione con composti co-inibitori noti, come anti-LF3A; come pure altri principi attivi, di per sé noti, in subordine alla condizione che deve essere trattata. Le composizioni dell’invenzione possono essere ad esempio formulate o usate in combinazione con immunosoppressivi (ovvero, per prevenire il rigetto di un trapianto), immunomodulanti, antibiotici, auto-antigeni o allergeni (ad esempio come descritto in WO 95/3234 o WO 96/23882), fattore di necrosi tumorale (TNF), e agenti antivirali, come agenti anti-HIV e inibitori di CD4, tra cui anticorpi diretti su CD4, ad esempio Leu-3A, attraverso cui è possibile ottenere ancora un effetto sinergico.
Le composizioni dell’invenzione possono essere inoltre formulate usando nuovi trasportatori e/o adiuvanti per fornire una forma farmeceutica di per sé nota, come una compressa, capsula, polvere, preparazione essiccata per congelamento, soluzione da iniezione, ecc, preferibilmente in una forma di dosaggio unitaria. Tali forme farmaceutiche, loro uso e somministrazione (con forma di dosaggio unitaria o multipla), come pure trasportatori, eccipienti, adiuvanti e/o formulanti, da usare al loro interno, sono generalmente noti nel ramo e sono ad esempio descritti in WO 93/01820, WO 95/32734, WO 96/23882, WO 98/02456, WO98/41633 e/o WO 98/49306, questi ultimi essendo tutti incorporati in queste sede tramite rimando. La formulazione può essere inoltre nella forma di un liposoma, come descritto in WO 93/01820.
Formulazioni farmaceutiche e anticorpi, loro somministrazione e uso, sono descritti in generale in WO 95/32734, WO 96/23882, WO 98/02456, WO 98/41633 e/o WO 98/49306.
Le composizioni dell’invenzione possono essere inoltre confezionate, ad esempio in fiale, bottiglie, buste, blister, ecc; opzionalmente con bugiardini informativi pertinenti per il paziente e/o istruzioni per l’uso.
Le composizioni dell’invenzione possono essere usate per modulare la risposta immune in un animale, nella fattispecie un essere umano o altro animale, mediante somministrazione a detto animale di un anticorpo che si lega o che può legarsi a un DC-SIGN sulla superficie di una cellula dendritica, preferibilmente nella forma di una composizione come sopra descritta, in quantità sufficiente tale da alterare o modificare una risposta immune.
L'anticorpo o la composizione è in particolare somministrata in una quantità tale da alterare o modificare le una o più interazioni tra cellule dendritiche e cellule T, più in particolare in una quantità tale da ridurre l’adesione delle cellule dendritiche alle cellule T.
Questo metodo può essere usato per prevenire e/o trattare disordini del sistema immune, come pure per prevenire un rigetto di trapianto, come sopra descritto.
La composizione dell’invenzione può essere usata per la prevenzione o trattamento di infezioni da HIV, mediante somministrazione a un paziente infettato da HIV, o una persona che corre il rischio di essere infettata da HIV, di un anticorpo che può legarsi o che si lega a DC-SIGN sulla superficie di una cellula dendritica, in una quantità tale da inibire l’adesione di HIV sulle cellule dendritiche, e in particolare dell'adesione tra la proteina d’involucro di HIV gp120 e DC-SIGN sulla superficie delle cellule dendritiche.
In tutti i metodi e forme esecutive precedenti, i composti/composizioni usati saranno somministrati in una quantità terapeuticamente efficace, e per quest’ultimo termine si fa generale rimando a WO 93/01820, WO 95/32734 e/o WO 96/23882. La somministrazione può essere in una dose singola, tuttavia fa preferibilmente parte di un regime di somministrazione multidose, svolto per uno o più giorni, settimane o mesi.
Tutti i termini usati in questa sede hanno l’usuale significato nel ramo, per cui è possibile fare rimando, inter alia, alle definizioni fornite in WO 93/01820, WO 95/32734, WO 96/23882, WO 98/02456, WO98/41633 e/o WO 98/49306, applicati in maniera analoga.
Inoltre, benché l’invenzione sia descritta in questa sede con riferimento allo specifico recettore di lectina tipo C di 44kDa, denominato DC-SIGN, divulgato in questa sede, non si esclude che altre lectine tipo C, generalmente simili tra loro, tra cui varianti naturali della sequenza SEQ ID no.1 e figura 9, possano anche essere presenti su cellule dendritiche e/o possano essere implicate nell’interazione cellula dendritica–cellula T. Tali varianti avranno solitamente un alto grado di omologia di amminoacidi (da più di 80% a più di 90%) con, e/o essendo funzionalmente equivalenti alla specifica lectina tipo C divulgata in questa sede. Inoltre, qualsivoglia di tale recettore in genere esibirà proprietà simili a quelle descritti in questa sede; in particolare, tali che l’inibizione del recettore, tramite inibitori carboidratici o anticorpi specifici, porterà a un'alterazione dell’interazione cellula dendritica/cellula T. Qualsivoglia di tali varianti di recettore dovrebbe essere tuttavia distinta dal recettore di lectina tipo C divulgato in WO 96/23882, la cui inibizione non comporta l’inibizione dell’interazione tra cellule dendritiche e cellule T.
L’invenzione sarà ulteriormente illustrata mediante la sezione sperimentale, fornita di seguito, nonché dalle figure in cui:
- Le figure 1A - 1C sono grafici che mostrano: la spontanea adesione di leucociti a ICAM-1 e ICAM-3 (fig. 1A); l’adesione di leucociti a ICAM-3 dopo attivazione delle integrine β2 (fig. 1B); l’adesione di DC a ICAM-3 in presenza di anticorpi bloccanti (20µg/ml) contro le integrine β2 (NKI-L19), integrina β1 (AIIB2), ICAM-3 (CBR-IC3/1, CBR-IC3/2) o in presenza di EDTA (5mM) o EGTA (5mM) (fig. 1C).
- Le figure 2A - 2C sono grafici che mostrano che gli anticorpi AZN-D1 e AZN-D2 inibiscono l’adesione di DC a ICAM-3 e riconoscono un antigene che è specificamente espresso dalle DC.
- Le figure 3A e 3B mostrano che DC-SIGN è identico alla lectina tipo C, legante gp 120 di HIV, di placenta umana, come è possibile osservare in SDS-PAGE (fig. 3A) e nella rappresentazione schematica di DC-SIGN isolato da DC umane (3B).
- Le figure 4A e 4B mostrano che DC-SIGN, sovraespresso in cellule COS7, è riconosciuto dall’anticorpo anti-DC-SIGN, AZN-D 1, e che si lega a ICAM-3.
- La figura 5 mostra la distribuzione tissutale di DC-SIGN come illustrato mediante analisi immunoistochimica dell’espressione di DC-SIGN in sezioni di tonsille (A e B) e linfonodo (C e D) (OMx100).
- Le figure 6A - 6D mostrano che l’adesione mediata da DC-SIGN di DC e ICAM-3 è implicata nell'interazione DC-linfocita T, come dimostrato dall’adesione mediata da DC-SIGN di DC a ICAM-3 (fig. 6A); agglomerazione eterotipica di cellule DC con cellule K562-ICAM-3 (fig. 6B); agglomerazione dinamica di cellule DC con PBL quiescenti (fig. 6C); e il ruolo che ricopre l’interazione DC-SIGN-ICAM-3 nella proliferazione di cellule T indotta da DC (fig. 6D).
- La figura 7 mostra che DC SIGN è un recettore di HIV-1 su DC.
- La figura 8 mostra che DC SIGN si lega a cellule K562 esprimenti sia ICAM-3 che ICAM-3.
- la figura 9 mostra le sequenza di DC-SIGN.
Sezione sperimentale
Le cellule dendritiche (DC) catturano antigeni e migrano verso tessuti linfoidi secondari, dove presentano gli antigeni a cellule T naïve. HIV-1 approfitta di questa esclusiva capacità, per ottenere l’ingresso nelle cellule T CD4 . Nell’invenzione, è stata clonata una specifica lectina tipo C, denominata DC-SIGN, che non soltanto si lega a ICAM-2 e/o ICAM-3 con elevata affinità, ma che è inoltre in grado di legare HIV-1. Inoltre, sono stati sviluppati anticorpi anti-DC-SIGN che non solo inibiscono le interazioni transienti DC-cellula T e la proliferazione di cellule T indotta da DC, ma che inibiscono anche in modo efficace l’infezione di HIV-1 delle DC. Queste scoperte, oltre ad avere importanti conseguenze per la comprensione dell’ingresso CD4-independente di HIV nelle DC, gettano anche nuova luce sul ruolo di DC-SIGN nella promozione di risposte immuni primarie.
Esempio 1: L’adesione di DC a ICAM-3 non è mediata da integrine
È stato studiato il ruolo dell'adesione mediata da ICAM-3 al primo contatto DC-cellula T. Eseguendo un nuovo saggio di adesione flussocitometrico, che implica sferette fluorescenti rivestite con chimere ICAM-3-Fc (Geijtenbeek et al.), è stata testata la capacità di DC, linfociti quiescenti di sangue periferico (PBL) e monociti di legarsi a questo ligando integrinico. DC immature, ottenute dopo coltura di monociti per 7 giorni in presenza di IL-4 e GM-CSF, legano fortemente ICAM-3 senza una precedente attivazione delle integrine β2 (72%, figura 1A). La figura 1 dimostra che l’adesione di DC a ICAM-3 è Ca2 -dipendente e integrina-indipendente: nelle Figg. 1A, B e C, è mostrato un esperimento rappresentativo di almeno 3 esperimenti (DS
Italian: SEGMENTARY DISTALIZATION ELEMENT FOR ORTHODONTIC TREATMENTS
Source text - Italian SEGMENTARY DISTALIZATION ELEMENT FOR ORTHODONTIC TREATMENTS
[0001] The present invention discloses an element for
the segmental distalisation of the canine- to- molar posterior
maxillary sector for orthodontic treatments which affords
significant advantages over the currently known elements
for this purpose.
[0002] Auxiliary elements for segmental distalisation
are known in this art, for example those corresponding
to Spanish patent application No. 200102210 in the name
of the same applicant.
[0003] With the auxiliary element for segmental distalisation
according to the aforementioned patent in the
name of the same applicant there was disclosed the formation
of said auxiliary element in two parts, namely a
median segment equipped with an enlargement intended
to be fixed to the canine by means of adhesive and an
arcuate arm ending with a ball which is introduced into a
small arcuate receiving shoe fixed to the upper molar by
adhesive.
[0004] Although the invention according to the aforementioned patent represented a significant advance over
formerly known devices, it had specific problems owing
to its production in two parts due to the relative production
costs and the relatively awkward handling of the two- part
assembly.
[0005] The inventor carried out research to obtain novel
improvements to segmental distalisation devices and
arrived at the present invention.
[0006] As the fruit of the investigations and tests, the
inventor has developed the present distalisation device
of which a specific characteristic is the single- part construction, the ease of adaptation thereof owing to inherent
design characteristics and the production thereof from a
metallic material which is preferably of the type known
as super- resilient or a thermoelastic material which has
the necessary characteristics of adequate toughness
and resilience.
[0007] Basically, the new segmental distalisation element
is characterised in that it comprises a single- part
elongate body having, at one end, a terminal which can
be adapted to the external surface of the canine and
which has an attachment for the resilient means, while
the other end has, with interposition of a zone of greater
flexibility, a shoe which can be coupled to the molar of
the upper portion, preferably by an adhesive or other
means.
[0008] In a preferred solution, the zone of greater resilience
will consist of a simultaneous double elbow with
a constriction of the material cross- section.
[0009] The portion with a double elbow and constriction
is characterised in that it has two successive angle
folds and at the same time a constriction of the cross
section of the material between the central portion of the
distalisation element and the end or terminal for coupling
to the molar. The first of the angles, in other words the
angle which connects the intermediate elbow to the main
element or arcuate bridge of the distalisation element will
preferably be an obtuse angle while the second angle,
in other words the angle between the intermediate bridge
of smaller cross- section and the end shoe for application
to the molar, can be a slightly obtuse or right angle. The
angle between the end of the central arm of the device
and the longitudinal axis of the shoe for fixing to the canine
will also be of interest for defining the structure of
the distalisation element according to the present invention.
[0010] The zone equipped with a constriction and
which has two successive angles will preferably have a
significant constriction and can similarly be formed by
two fine parallel arms which define an intermediate aperture
or other similar form.
[0011] However, the zone of greater flexibility preceding
the element which can be adapted to the molar may
be produced in a wide variety of forms and not necessarily
with the double elbow provided for the preferred embodiment.
Thus, for example, instead of a double elbow, a
smooth curved zone, an omega like or similarly shaped
zone with an open or closed shape, or a zone with one
or more helical turns in an arrangement resembling a
helical spring may be provided.
[0012] The accompanying drawings of a preferred embodiment
of the invention, given as non- limiting examples,
will assist the understanding thereof.
Fig. 1 is a lateral elevation of a distalisation segment
according to the present invention.
Fig. 2 is a front elevation of the actual segment.
Fig. 3 is an elevation showing a detail of the double
elbow at the end corresponding to the fixing to the
molar.
Fig. 4 is a plan view of the elements shown in Fig. 3.
Fig. 5 is a cross- section through the sectional plane
indicated with various alternative shapes.
Fig. 6, 7 and 8 are views similar to Fig. 3, 4 and 5
for the version of elbowed zone with an intermediate
window.
Fig. 9 shows a variation in which the portion of greater
resilience has a smaller cross- section and a substantially
curved sinusoidal or omega- shaped form
or the like.
Fig. 10 shows a second variation in which the more
flexible portion forms a closed omega- shaped handle
or the like.
Fig. 11 and 12 show respective helical versions with
one turn.
Fig. 13 shows an arrangement in the form of a
smooth curve.
Fig. 14 and 15 show respective helical shapes in a
form similar to a spring in the upper and lower portion
respectively.
Fig. 16 and 17 show an arrangement with a loop
directed laterally with respect to the positional convention
used in the previous figures.
[0013] As shown in the drawings, the distalisation el-
1 2
EP 1 681 033 B1
3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
ement according to the present invention comprises, in
a single part, a smoothly arcuate main body 1 of substantial
length which terminates at one end with a head
2 for fixing it to the canine and at the other end with a
head 3 for fixing it to the molar on the same side, having
respective curved internal zones 4 and 5 for better adaptation
to the canine and molar respectively and a variable
number of reliefs such as the ribs 6 and 7, grating
profiles, grids or other types of roughness intended to
improve the fixing to the aforementioned tooth parts using
an adhesive.
[0014] The distalisation element according to the
present invention has the basic characteristic of comprising a more flexible zone preferably in the form of a curved,
constricted zone in various dispositions. In a preferred
embodiment, said more flexible zone will adopt the form
of a double- elbow connecting bridge 8 between the central
arm 1 and the end head 3 for adaptation to the molar.
Said double- elbow- shaped bridge or zone will also have
a significant reduction in the material cross- section, resulting
in significant flexibility in the end zone 3 which will
allow better adaptation thereof and will therefore allow
the production of the distalisation segment in a single
part.
[0015] The double elbow will be produced by means
of a first, preferably obtuse, angle 9 and a second slightly
obtuse or else right angle 10. In addition to said angles,
of which the first is indicated by the letter a, the angle b
will also be important, this angle being formed between
the axis 1 of the end 12 of the arm 1 and the axis 13
which substantially corresponds to the longitudinal axis
of the head 3 which preferably adopts the form of a small
shoe 14 of rectangular or oval construction.
[0016] It will be appreciated that, despite the aforementioned
quantities relating to the angles of the double elbow,
the values of the angles can vary within wide limits,
according to the prerequisites of the distalisation device.
[0017] As mentioned, the zone of the double elbow,
which is indicated by reference numeral 15, has a significant
constriction with respect to the central portion 1,
which can either be achieved by a constriction in crosssection
as shown in Fig. 1 and 2 to form a single connecting
bridge between the central element or arm 1 and
the end head 14 or be formed by means of a constricted
zone 17, Fig. 6 and 7, which will also have a central aperture
18 determining parallel arms 19 and 20 of which
the precise shape can vary greatly, Fig. 8 showing three
versions in which the first one 21 has two arms with a
circular cross- section, the second, indicated by reference
numeral 22, has two arms with a rectangular cross- section
and the third 23 has two arms with an oval crosssection,
or, as will be appreciated, the with form of said
arms varying greatly.
[0018] Also in the case of the constriction in the zone
16 shown in Fig. 1 to 4, the cross- section can assume
various specific shapes such as those designated by reference
numerals 24 for a half- rod- shaped section, 25 for
a circular section, 26 for a substantially rectangular sec-
tion or 27 for an oval section, or else the shape of said
cross- section can vary within wide limits.
[0019] The various views show the upper face of the
end head 14 with a flat shape, taking into account the
fact that said shape is intended to allow the possible joining
of a molar tube to allow complementary actions.
[0020] Fig. 9 to 17 show various additional versions of
the flexible zone between the portion of the central element
of the device and the zone for adaptation to the
molar. Thus, for example, Fig. 9 shows the arrangement,
between said central zone 1 and the end zone 3 which
can be adapted to the molar, of a singly curved zone 28
which can have a sinusoidal, omega or similar shape.
[0021] Fig. 10 shows a version in which the zone of
greater flexibility consists of a closed curve 29 in the form
of an omega or another form.
[0022] Fig. 1 and 12 show respective versions 30 and
31 in the form of loops which are directed toward the
upper portion and lower portion respectively.
[0023] Fig. 13 shows a version in which a smooth
curved zone 32 is disposed singly between the central
portion 1 of the device and the end head for application
to the molar.
[0024] Fig. 14 and 15 show respective versions in
which the zones of greater flexibility 33 and 34 are produced
by means of respective elements of helical shape
with a plurality of turns, in other words in the manner of
a spring, directed upwardly and downwardly respectively.
[0025] Fig. 16 and 17 show a lateral elevation and a
plan view of an embodiment in which the zone of greater
flexibility 35 is formed by a loop or the like situated in a
disposition which can be described as lateral, based on
the convention employed in the previous figures, in which
the loops which, simultaneously with the reduction in
cross- section, impart the greatest flexibility are disposed
in a plane perpendicular to that of the embodiments
shown in the earlier figures. It is obvious that the disposition
shown in Fig. 16 and 17 could be found on either
of the sides determined by the longitudinal plane of symmetry.
Similarly, although not shown, other planes which
are intermediate to those shown could be used for said
loops and similar elements.
[0026] Although not shown in the figures, the invention
will similarly allow the production of the more flexible connection
zone, between the central portion of the distalisation
segment and the head for fixing to the molar, from
a metal part made of a more highly adaptable metal such
as, for example, stainless steel. In this case, the constriction in said zone of greater flexibility may be omitted since
the adaptation can be achieved partially by direct bending
of said metal part.
[0027] The materials for producing the distalisation element
according to the present invention can be varied,
providing that the mechanical characteristics, in particular adequate toughness and resilience, necessary for the
operation thereof are achieved. In particular, a metal material of the type known as super- resilient, steel, thermoe-
3 4
EP 1 681 033 B1
4
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
lastic materials or a plastics material, for example a polymer,
may be provided.
[0028] Super- resilient materials include those known
as Ni- Ti such as Cu, Ni, Ti and Cr alloys.
Claims
1. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments, comprising an elongate single- part element
having a smoothly arcuate central body (1)
equipped, at one end, with a head (2) for adaptation
to the canine and, at the other end, with a head (3)
for adaptation to the molar, characterized in that
the arcuate body (1) is connected to the end head
(3) via a zone of greater flexibility (8) with a smaller
cross- section than the remainder of the element, to
increase the resilience of the distalisation element
in said zone and achieve easy, direct adaptation.
2. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments according to claim 1, characterised in
that the zone of reduced cross- section has two successive
angles (9, 10), the first angle (9) being between
the central arcuate portion of the distalisation
element and the reduced- section intermediate
bridge for connection to the head for adaptation to
the molar and the second angle (10) being in the
actual intermediate bridge before its connection to
said head (3) for adaptation to the molar.
3. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments according to claim 1, characterised in
that the reduction in the cross- section of the bridge
for connection to the end head (3) for coupling to the
molar is obtained by providing a single bridge of reduced
cross- section.
4. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments according to claim 1, characterised in
that the constricted zone of the bridge for connection
to the head (3) for attachment to the molar is obtained
by providing an aperture or apertures to make the
connecting bridge more flexible.
5. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments according to claim 1, characterised in
that the zone of greater flexibility (8) consists of a
segment which is singly curved with smooth curvature
(32).
6. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments according to claim 1, characterised in
that the zone of greater flexibility (8) consists of a
closed loop (29, 30, 31, 35).
7. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments according to claim 1, characterised in
that the zone of greater flexibility (8) consists of one
or more turns (33, 34).
8. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments according to claim 2, characterised in
that the angles (9, 10) of the double elbow are obtuse
angles.
9. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments according to claim 1, characterised in
that it is produced from a super- resilient material.
10. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments according to claim 1, characterised in
that it is produced from a plastics material.
11. Segmental distalisation element for orthodontic
treatments according to claim 1, characterised in
that it is produced from thermoelastic material.
Patentansprüche
1. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen, umfassend ein längliches einteiliges
Element mit einem leicht bogenförmigen
zentralen Körper (1), der an einem Ende mit einem
Kopf (2) zur Anpassung an den Eckzahn und am
anderen Ende mit einem Kopf (3) zur Anpassung an
den Molaren ausgestattet ist, dadurch gekennzeichnet,
dass der bogenförmige Körper (1) mit
dem Endkopf (3) über eine Zone (8) größerer Flexibilität
mit einem kleineren Querschnitt als der Rest
des Elements verbunden ist, um die Nachgiebigkeit
des Distalisationselements in dieser Zone zu erhöhen
und einfache, direkte Anpassung zu erreichen.
2. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass die Zone reduzierten Querschnitts
zwei aufeinander folgende Winkel (9, 10)
aufweist, wobei sich der erste Winkel (9) zwischen
dem zentralen bogenförmigen Abschnitt des Distalisationselements
und der querschnittsreduzierten
Zwischenbrücke für die Verbindung mit dem Kopf
zur Anpassung an den Molaren befindet und sich
der zweite Winkel (10) in der eigentlichen Zwischenbrücke
vor ihrer Verbindung mit dem Kopf (3) zur
Anpassung an den Molaren befindet.
3. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass die Reduzierung im Querschnitt
der Brücke zur Verbindung mit dem Endkopf
(3) zum Ankoppeln an den Molaren durch Bereitstellen
einer einzelnen Brücke reduzierten Querschnitts
erreicht wird.
5 6
EP 1 681 033 B1
5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
4. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass die verengte Zone der Brücke
zur Verbindung mit dem Kopf (3) zum Anbringen an
den Molaren durch Bereitstellen einer Öffnung oder
Öffnungen erreicht wird, um die Verbindungsbrücke
flexibler zu machen.
5. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass die Zone (8) größerer Flexibilität
aus einem Segment besteht, das mit einer einzigen
leichten Krümmung (32) gekrümmt ist.
6. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass die Zone (8) größerer Flexibilität
aus einer geschlossenen Schleife (29, 30, 31,
35) besteht.
7. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass die Zone (8) größerer Flexibilität
aus einer oder mehreren Windungen (33, 34)
besteht.
8. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass die Winkel (9, 10) des Doppelellbogens
stumpfe Winkel sind.
9. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass es aus einem super- nachgiebigen
Material hergestellt ist.
10. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass es aus einem Kunststoff- Material
hergestellt ist.
11. Segmentdistalisationselement für kieferorthopädische
Behandlungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es aus thermoelastischem Material
hergestellt ist.
Revendications
1. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements
orthodontiques, comprenant un élément
oblong d’un seul tenant avec un corps central arqué
de façon uniforme (1) muni, sur une extrémité, d’une
tête (2) pour l’adaptation sur la canine et, sur l’autre
extrémité, d’une tête (3) pour l’adaptation sur la molaire,
caractérisé en ce que le corps arqué (1) est
raccordé à la tête d’extrémité (3) par l’intermédiaire
d’une zone de plus grande souplesse (8) ayant une
section transversale plus petite que le reste de l’élé-
ment, pour augmenter l’élasticité de l’élément de distalisation
dans ladite zone et permettre une adaptation
facile et directe.
2. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements orthodontiques selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la zone de section transversale
réduite présente deux angles successifs (9, 10), le
premier angle (9) se situant entre la portion arquée
centrale de l’élément de distalisation et le pont intermédiaire
à section réduite pour le raccordement sur
la tête destiné à l’adaptation sur la molaire, et le second angle (10) se situant dans le pont intermédiaire
proprement dit avant son raccordement sur ladite
tête (3) pour l’adaptation sur la molaire.
3. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements orthodontiques selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la réduction dans la section
transversale du pont pour le raccordement sur la tête
d’extrémité (3) destiné à l’accouplement sur la molaire
s’obtient en prévoyant un pont unique de section
transversale réduite.
4. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements orthodontiques selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la zone étranglée du pont pour
le raccordement sur la tête (3) destiné à la fixation
sur la molaire s’obtient en prévoyant une ouverture
ou des ouvertures pour rendre le pont de raccordement
plus souple.
5. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements orthodontiques selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la zone de plus grande souplesse
(8) consiste en un segment qui est uniquement
incurvé avec une courbure douce (32).
6. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements orthodontiques selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la zone de plus grande souplesse
(8) consiste en une boucle fermée (29, 30,
31, 35).
7. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements orthodontiques selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la zone de plus grande souplesse
(8) consiste en une ou plusieurs spires (33,
34).
8. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements orthodontiques selon la revendication 2, caractérisé
en ce que les angles (9, 10) du double
coude sont des angles obtus.
9. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements orthodontiques selon la revendication 1, ca-
7 8
EP 1 681 033 B1
6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
ractérisé en ce qu’il est produit à partir d’un matériau
super- élastique.
10. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements orthodontiques selon la revendication 1, caractérisé
en ce qu’il est produit à partir d’un matériau
plastique.
11. Elément de distalisation segmentaire pour des traitements
orthodontiques selon la revendication 1,
caractérisé en ce qu’il est produit à partir d’un matériau
thermo élastique.
9 10
EP 1 681 033 B1
7
EP 1 681 033 B1
8
EP 1 681 033 B1
9
EP 1 681 033 B1
10
EP 1 681 033 B1
11
EP 1 681 033 B1
12
EP 1 681 033 B1
13
EP 1 681 033 B1
14
EP 1 681 033 B1
15
REFERENCES CITED IN THE DESCRIPTION
This list of references cited by the applicant is for the reader’s convenience only. It does not form part of the European
patent document. Even though great care has been taken in compiling the references, errors or omissions cannot be
excluded and the EPO disclaims all liability in this regard.
Patent documents cited in the description
• ES 200102210 [0002]
Translation - Italian ELEMENTO SEGMENTATO DI DISTALIZZAZIONE PER TRATTAMENTI ORTODONTICI
Descrizione
La presente invenzione divulga un elemento per la distalizzazione segmentale di un settore mascellare posteriore canino-molare per trattamenti ortodontici, che fornisce vantaggi significativi rispetto agli elementi attualmente noti per questo scopo.
Sono noti nel ramo elementi ausiliari per la distalizzazione segmentale, ad esempio quelli che corrispondono alla domanda di brevetto spagnolo n. 200102210 al nome dello stesso richiedente.
Con l’elemento ausiliare per la distalizzazione segmentale secondo il brevetto sopra menzionato, al nome dello stesso richiedente, è stata divulgata la formazione bipezzo di detto elemento ausiliare, ovvero un segmento mediano munito di un allargamento inteso per essere fissato al canino tramite un adesivo, e un’estremità di braccio arcuato con una sfera, che viene introdotta in una piccola fessura arcuata ricevente, fissata sul molare superiore tramite un adesivo.
Benché l’invenzione secondo il sopra menzionato brevetto rappresenti un significativo avanzamento rispetto ai dispositivi abitualmente noti, esso presenta specifici problemi relativi alla sua produzione bipezzo, a causa dei costi relativi di produzione e della scomoda manipolazione dell’assemblaggio bipezzo.
L’inventore ha condotto una ricerca per conferire migliorie innovative ai dispositivi di distalizzazione segmentale, il che ha condotto alla presente invenzione.
Come risultato delle ricerche e dei test, l’inventore ha sviluppato il presente dispositivo di distalizzazione, di cui una caratteristica specifica è la costruzione monopezzo, la sua facilità di adattamento, relativa alle sue intrinseche caratteristiche di disegno, e la produzione da un materiale metallico che è preferibilmente del tipo noto come super-elastico o da un materiale termoelastico che esibisce le necessarie caratteristiche di durezza e resilienza opportune.
In generale, il nuovo elemento di distalizzazione segmentale è caratterizzato dal fatto di comprendere un corpo allungato monopezzo, provvisto, a un’estremità, di una porzione terminale che può essere adattata alla superficie esterna del canino e che ha un struttura di fissaggio per i mezzi elastici, mentre l’altra estremità, dopo interposizione di una zona di maggiore flessibilità, possiede una fessura che può essere accoppiata al molare della porzione superiore, preferibilmente tramite un adesivo o altri mezzi.
In una soluzione preferita, la zona di maggiore resilienza sarà costituita da un doppio gomito simultaneo, con un restringimento della sezione trasversale del materiale.
La porzione con doppio gomito e restringimento è caratterizzata dal fatto di possedere due successivi piegature angolari e, allo stesso tempo, un restringimento della sezione trasversale del materiale tra la porzione centrale dell’elemento di distalizzazione e l’estremità o il terminale per l’accoppiamento al molare. Il primo degli angoli, ovvero l’angolo che collega il gomito intermedio all’elemento principale o al ponte arcuato dell'elemento di distalizzazione, sarà preferibilmente un angolo ottuso, mentre il secondo angolo, ovvero l'angolo tra il ponte intermedio di sezione trasversale più piccola e la fessura terminale per l’applicazione al molare, può essere un angolo leggermente ottuso o retto. Sarà inoltre d'interesse per la definizione della struttura dell'elemento di distalizzazione secondo la presente invenzione l’angolo tra l’estremità del braccio centrale del dispositivo e l'asse longitudinale della fessura per il fissaggio al canino.
La zona munita di un restringimento e che presenta due successivi angoli avrà preferibilmente un restringimento significativo, potendo essere formata in modo simile tramite due bracci paralleli sottili, che delineano un'apertura intermedia o una forma similare.
La zona di maggiore flessibilità, che precede l’elemento che può essere adattato al molare, può essere tuttavia prodotto in un’ampia gamma di forme, non necessariamente con un doppio angolo provvisto per la forma esecutiva preferita. Così, ad esempio, al posto di un doppio gomito, è possibile provvedere una zona a dolce curvatura, una zona ad omega, o di forma similare, con una forma aperta o chiusa, oppure una zona con una o più spire in una disposizione simile a una molla elicoidale.
I disegni di accompagnamento di una forma esecutiva preferita dell’invenzione, presentati come esempi non limitativi, agevoleranno la comprensione dell’invenzione stessa.
La Fig. 1 è un’elevazione laterale di un segmento di distalizzazione secondo la presente invenzione.
Fig. 2 è un’elevazione frontale del presente segmento.
La Fig. 3 è un’elevazione che mostra un dettaglio del doppio gomito all’estremità che corrisponde al fissaggio al molare.
La Fig. 4 è una vista in pianta degli elementi mostrati in Fig. 3.
La Fig. 5 è una sezione trasversale attraverso il piano sezionale indicato con varie forme alternative.
Le Fig. 6, 7 e 8 sono viste simili alle Fig. 3, 4 e 5 per la versione della zona a gomito con una finestra intermedia.
La Fig. 9 mostra una variazione in cui la porzione di maggiore resilienza ha una sezione trasversale più piccola e una forma sinusoidale sostanzialmente curvata o a forma ad omega o similare.
La Fig. 10 mostra una seconda variazione in cui la porzione più flessibile forma un’impugnatura chiusa ad omega o similare.
Le Fig. 11 e 12 mostrano rispettive versioni elicoidali con una spira.
La Fig. 13 mostra un allargamento nella forma di una curva dolce.
Le Fig. 14 e 15 mostrano rispettive forme elicoidali in una forma simile a una molla, rispettivamente nella porzione superiore e inferiore.
Le Fig. 16 e 17 mostrano una disposizione con un’ansa diretta in senso laterale rispetto alla convenzione posizionale usata nelle precedenti figure.
Come mostrato nei disegni, l'elemento di distalizzazione secondo la presente invenzione comprende, monopezzo, un corpo principale 1 dolcemente arcuato di lunghezza sostanziale, che termina ad una estremità con una testa 2 per fissarlo al canino, e all'altra estremità con una testa 3 per fissarlo al molare sullo stesso lato, avente rispettive zone interne curve 4 e 5 per un migliore adattamento al canino e al molare, rispettivamente, e un numero variabile di rilievi come le nervature 6 e 7, profili reticolari, griglie o altri tipi di scabrosità, destinati a migliorare il fissaggio alle succitate parti di dente usando un adesivo.
L’elemento di distalizzazione secondo la presente invenzione ha la caratteristica generale di comprendere preferibilmente una zona più flessibile nella forma di una zona curvata che ha un restringimento, in varie disposizioni. In una forma esecutiva preferita, detta zona più flessibile adotterà la forma di un ponte di collegamento a doppio gomito 8 tra il braccio centrale 1 e la testa d’estremità 3 per l’adattamento al molare. Detto ponte o zona a forma di doppio gomito avrà inoltre una significativa riduzione nella sezione trasversale del materiale, che impartisce una significativa flessibilità alla zona terminale 3, che consentirà un suo migliore adattamento e che permetterà quindi la produzione del segmento di distalizzazione monopezzo.
Il doppio gomito sarà prodotto tramite un primo angolo, preferibilmente ottuso, 9, e un secondo angolo leggermente ottuso o altrimenti retto 10. Oltre a detti angoli, di cui il primo è indicato con la lettera α, sarà inoltre importante l’angolo β, essendo tale angolo formato tra l’asse 1 dell’estremità 12 del braccio 1 e l’asse 13, che corrisponde sostanzialmente all’asse longitudinale della testa 3, che preferibilmente adotta la forma di piccola fessura 14 di costruzione rettangolare od ovale.
Sarà apprezzato che, in luogo delle sopra menzionate quantità relative agli angoli del doppio gomito, i valori degli angoli possono variare entro ampi limiti, secondo i prerequisiti del dispositivo di distalizzazione.
Come menzionato, la zona del doppio gomito, che è indicata con il numerale di riferimento 15, presenta un significativo restringimento, non presente nella porzione centrale 1, che può essere ottenuto mediante restringimento della sezione trasversale, come mostrato nelle Fig. 1 e 2, formando un singolo ponte di collegamento tra l’elemento centrale, o braccio 1, e la testa d’estremità 14, oppure può essere formato tramite una zona di restringimento 17, Fig. 6 e 7, che inoltre presenterà un’apertura centrale 18 che determina i bracci paralleli 19 e 20, la cui forma precisa può variare ampiamente, Fig. 8, che mostra tre versioni in cui la prima, 21, ha due bracci con una sezione trasversale circolare, la seconda, indicata con il numerale di riferimento 22, ha due bracci con una sezione trasversale rettangolare, e la terza, 23, ha due bracci con una sezione trasversale ovale oppure, come sarà apprezzato, in cui la forma associata può variare ampiamente.
Inoltre, nel caso del restringimento nella zona 16, mostrata dalla Fig. 1 a 4, la sezione trasversale può assumere varie forme specifiche, come quelle indicate con i numerali di riferimento 24 per una sezione emibastoncellare, 25 per una sezione circolare, 26 per una sezione sostanzialmente rettangolare o 27 per una sezione ovale, oppure la forma di detta sezione trasversale può altrimenti variare entro ampi limiti.
Le varie viste mostrano la faccia superiore della testa d’estremità 14 con una forma piatta, prendendo in considerazione il fatto che detta forma è intesa per consentire il possibile collegamento di un tubo molare che permette azioni complementari.
Le Fig. da 9 a 17 mostrano varie versioni aggiuntive della zona flessibile tra la porzione dell'elemento centrale del dispositivo e la zona per l'adattamento al molare. Quindi, la Fig. 9 mostra ad esempio la disposizione, tra detta zona centrale 1 e detta zona terminale 3, che può essere adattata al molare, di una zona a curva singola 28 che può avere una forma sinusoidale ad omega o similare.
La Fig. 10 mostra una versione in cui la zona di maggiore flessibilità è costituita da una curva chiusa 29 nella forma ad omega o altra forma.
Le Fig. 1 e 12 mostrano versioni rispettive 30 e 31 nella forma di anse che sono dirette rispettivamente verso la porzione superiore e la porzione inferiore.
Fig. 13 mostra una versione in cui una zona di curva dolce 32 è disposta singolarmente tra la porzione centrale 1 del dispositivo e la testa d’estremità per l’applicazione al molare.
Le Fig. 14 e 15 mostrano rispettive versioni in cui le zone di maggiore flessibilità 33 e 34 sono prodotte tramite rispettivi elementi di forma elicoidale con una pluralità di spire, ovvero nella forma di una molla, rispettivamente dirette verso l'alto e il basso.
Le Fig. 16 e 17 mostrano un’elevazione e una vista in pianta di una forma esecutiva, in cui la zona di maggiore flessibilità 35 è formata da un’ansa, o similare, situata in una disposizione che può essere descritta come laterale in base della convenzione usata nelle precedenti figure, in cui le anse che contemporaneamente con la riduzione della sezione trasversale conferiscono la maggiore flessibilità, sono disposte in un piano perpendicolare a quello delle forme esecutive mostrate nelle precedenti figure. È ovvio notare che la disposizione mostrata nelle Fig. 16 e 17 potrebbe essere presente su ambedue i lati determinati dal piano longitudinale di simmetria. In modo simile, anche se non è mostrato, altri piani che sono intermedi rispetto quello mostrati, potrebbero essere usati per dette anse ed elementi similari.
Sebbene non mostrato nelle figure, l’invenzione consente, allo stesso tempo, la produzione della zona di collegamento flessibile, tra la porzione centrale del segmento di distalizzazione e la testa per il fissaggio al molare, da una parte in metallo costituita di una metallo ampiamente adattabile, come ad esempio acciaio inossidabile. In questo caso, la restringimento in detta zona di maggiore flessibilità può essere omessa, poiché l'adattamento può essere ottenuto tramite legame diretto di detta parte in metallo.
I materiali destinati alla produzione dell’elemento di distalizzazione della presente invenzione possono variare, posto l’ottenimento delle caratteristiche meccaniche, in particolare l'adeguata durezza e resilienza, necessarie per la sua fase operativa. In particolare, può essere fornito un materiale metallico del tipo noto come super-elastico, acciaio, materiali termoplastici o un materiali plastico, ad esempio un polimero.
Materiali super-elastici comprendono quelli noti come Ni-Ti, ad esempio leghe di Cu, Ni, e and Cr.
Rivendicazioni
1. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici, comprendente un elemento monopezzo allungato avente un corpo centrale (1) dolcemente arcuato provvisto, ad una estremità, di una testa (2) per l'adattamento al canino e, all'altra estremità, di una testa (3) per l'adattamento al molare, caratterizzato dal fatto che il corpo arcuato (1) è collegato alla testa d'estremità (3) attraverso una zona di maggiore flessibilità (8) con una sezione trasversale più piccola del resto dell'elemento, così da aumentare la resilienza dell'elemento di distalizzazione in detta zona, e da ottenere un adattamento facile e diretto.
2. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la zona di sezione trasversale ridotta ha due angoli successivi (9, 10), il primo angolo (9) essendo tra la porzione arcuata centrale dell'elemento di distalizzazione e il ponte intermedio a sezione ridotta di collegamento alla testa per l'adattamento al molare, e il secondo angolo (10) essendo nel ponte intermedio vero e proprio, prima del suo collegamento a detta testa (3) per l'adattamento al molare.
3. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la riduzione nella sezione trasversale del ponte di collegamento alla testa d'estremità (3) per l'accoppiamento al molare è ottenuta provvedendo un singolo ponte di sezione trasversale ridotta.
4. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la zona ristretta del ponte di collegamento alla testa (3) per il fissaggio al molare è ottenuta provvedendo una apertura o più aperture allo scopo di rendere più flessibile il ponte di collegamento.
5. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la zona di maggiore flessibilità (8) è costituita da un segmento a curva singola di curvatura dolce (32).
6. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la zona di maggiore flessibilità (8) è costituita da un'ansa chiusa (29, 30, 31, 35).
7. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la zona di maggiore flessibilità (8) è costituita da una o più spire (33, 34).
8. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che gli angoli (9, 10) del doppio gomito sono angoli ottusi.
9. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che è prodotto da un materiale super-elastico.
10. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che è prodotto da un materiale plastico.
11. Elemento segmentato di distalizzazione per trattamenti ortodontici secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che è prodotto da un materiale termoelastico.
Italian: LONG LASTING GLUCAGON- LIKE PEPTIDE 2 (GLP- 2) FOR THE TREATMENT OF
Source text - Italian LONG LASTING GLUCAGON- LIKE PEPTIDE 2 (GLP- 2) FOR THE TREATMENT OF
GASTROINTESTINAL DISEASES AND DISORDERS
Description
FIELD OF THE INVENTION
[0001] This invention relates to glucagon- like peptide 2 (GLP- 2) derivatives. In particular, this invention relates to GLP2
peptide derivatives having an extended in vivo half-life, for the treatment or prevention of gastrointestinal disorders or
diseases such as inflammatory bowel disease and other gastrointestinal functions, from any segment of the gastrointestinal
tract, from the oesophagus to the anus.
BACKGROUND OF THE INVENTION
[0002] GLP- 2 is a 33 amino acid peptide expressed in a tissue- specific manner from the pleiotropic proglucagon gene,
and thus part of the glucagon super- family of peptide hormones. Alternative post- translational processing of proglucagon
occurs in pancreas, intestine and brain. Enzymatic cleavages in proglucagon produce numerous multifunctional peptide
hormones involved in nutrient metabolism. The major bioactive hormones derived from proglucagon are in the pancreatic
a- cells, and GLP- 1 and GLP- 2 in the intestinal L- cells and brain. It was first discovered to possess potent intestinotropic
properties by Drucker et al. (see Proc. Natl. Acad. Sci., 1996. 93, (115), 7911-7916). GLP- 2, as a natural intestinalderived
peptide, has been demonstrated to have a significant reparative activity for the mucosal epithelium of the small
and large intestine. It has also been demonstrated to increase the ability of the intestine to digest and absorb nutrients,
suggesting a potential therapeutic role in the treatment of intestinal insufficiency. Indeed, several studies have now
confirmed that GLP- 2 administration reduces or prevents intestinal damage in rodent models of colitis, enteritis, total
parenteral nutrition and massive resection. Very recently, phase 2 clinical trials of GLP- 2 have also been reported, in
which patients with short bowel syndrome were demonstrated to exhibit an enhanced ability to absorb enteral nutrients
after 30 days of GLP- 2 administration, with apparently no undesirable side effects.
[0003] The principal metabolic pathway for GLP- 2 clearance is through enzymatic degradation. GLP- 2 has been shown
to be rapidly degraded through the removal of its two N- terminal amino acids by dipeptidylpeptidase- IV (DPP- IV), which
represents a major limitation because it leads to the complete inactivation of the peptide. As a result, the half- life of GLP2
is thus quite short, and current GLP- 2 treatment necessitates infusion or frequent injections. Renal clearance has also
been shown to be involved in the clearance of GLP- 2. The major action of GLP- 2 involves stimulation of cell growth,
and the mechanism coupling GLP- 2 receptor activation, directly or indirectly, to cell proliferation has not been examined.
[0004] It has been shown that peptide analogs of native GLP- 2 possess enhanced trophic activity at the small intestine
as GLP- 2 receptor agonists (see for example US 5,990,077).
[0005] Although very useful, a critical disadvantage of GLP- 2 peptides and analogs, as stated above, is their very
short half- lives in vivo, which is typically not more than 2 minutes.
[0006] Inflammatory Bowel Disease (IBD) is a group of chronic disorders that cause inflammation or ulceration in the
small and large intestines. It may even be life threatening, and there is currently no known cure. IBD commonly refers
to ulcerative colitis (UC), limited to the colon and Crohn’s disease (CD) which can involve the entire gastrointestinal
tract, resulting in a chronic cycle of remissions and flares. Many pharmaceutical products are known to treat IBD, for
example to suppress inflammation, to prevent flare- ups, to control symptoms such as pain or diarrhea, or to replace or
supplement essential nutrients that are poorly absorbed because of extensive disease or surgery. Current treatment
options include a wide variety of pharmaceutical products like aminosalicylates, corticosteroids, immune modulators,
and anti- TNF- a agent, and are designed to reduce inflammation and relieve symptoms in addition to replacing lost fluids
and nutrients. Most of these products however have a limited use in IBD because of their undesirable side effects on
the body in general.
[0007] Approximately one million patients are treated for IBD every year in the United States and Europe, most of
them generally suffering from either Crohn’s disease or ulcerative colitis, In fact, it is not uncommon for subjects suffering
from IBD to undergo radical surgery involving the removal of major parts of the intestine. Direct annual healthcare costs
of IBD are approximately $US 700 million, and the total economic impact of both direct and indirect costs approximate
between $2 and $3 billion a year worldwide. Existing treatments, while often providing relief, have some shortcomings.
[0008] US 5,789,379 teaches GLP- 2 analogs among which one has been developed as a long- acting compound (ALX600™) and is currently in clinical trials. However, even if DPP- IV degradation of GLP- 2 appears to be somehow prevented,
its half- life remains limited by renal clearance, and does not exceed 2 minutes, as stated above.
[0009] A chimeric antibody (Remicade™ has been developed to bind specifically to human tumor necrosis factor alpha
(TNF- a) for the short- term treatment of Crohn’s. This antibody is indicated for the reduction of the symptoms of moderate
to severe Crohn’s disease in patients who have had an inadequate response to conventional therapy with corticosteroids,
other immunosuppressants and/or antibiotics. Nevertheless, serious side effects are observed with such treatment. For
example, it has been associated with hypersensitivity reaction, serious infections including sepsis, as well as fatal
infections. Its administration could further predispose patients to infections through TNF- blocking.
EP 1 360 202 B1
3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
[0010] With the prevalence of IBD increasing in recent years, it would therefore be highly desirable to develop GLP2 peptide derivatives or analogs capable of substantially maintaining the same level of activity, low toxicity and therapeutic
advantages as GLP- 2, but with a much longer in vivo half-life, thus avoiding the necessity for continuous administration
thereof in the treatment of various diseases such as inflammatory bowel disease, Crohn’s disease and ulcerative colitis
representing the two major inflammatory bowel diseases.
[0011] WO 00/69900 describes protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation
to blood components.
SUMMARY OF THE INVENTION
[0012] In accordance with the present invention, there is now provided a GLP- 2 gastrointestinal tissue growth promoter
derivative having an extended in vivo half-life when compared with the corresponding unmodified GLP-2 gastrointestinal
growth promoter. The present invention provides a gastrointestinal tissue growth promoter derivative selected from the
group consisting of:
His- Gly- Asp- Gly- Ser- Phe- Ser- Asp- Glu- Met- Asn- Thr- Ile- Leu- Asp- Asn- Leu- Ala- Ala- Arg- Asp- Phe- Ile- Asn- Trp- Leu-
Ile- Gln- Thr- Lys- Ile- Thr- Asp- Lys (MPA)-CONH 2 ; and His- Gly- Asp- Gly- Ser- Phe- Ser- Asp- Glu- Met- Asn- Thr- Ile- Leu-
Asp- Asn- Leu- Ala- Ala- Arg- Asp- Phe- Ile- Asn- Trp- Leu- Ile- Gln- Thr- Lys- Ile- Thr- Asp- Lys (AEEA- MPA)-CONH 2
where MPA is maleimidopropionic acid and AEEA is 2-[2-(2- amino) ethoxy] ethoxy acetic acid. The GLP- 2 derivative
comprises a reactive entity (MPA) coupled thereto and capable of reacting with available functionalities on a blood
component, either in vivo or ex vivo, to form a stable covalent bond. The covalent bonding formed between the GLP-2
derivative and the blood component prevents undesirable cleavage of the GLP- 2 by enzymes such as dipeptidylpeptidase
IV, thereby extending its in vivo half-life and activity.
[0013] Preferred blood components comprise proteins such as immunoglobulins, including IgG and IgM, serum albumin,
ferritin, steroid binding proteins, transferrin, thyroxin binding protein, a- 2- macroglobulin, haptoglobin etc., serum
albumin and IgG being more preferred, and serum albumin being the most preferred.
[0014] The reactive entity, maleimidopropionic acid (MPA), is capable of forming a covalent bond with the blood
component by reacting with thiol groups present thereon, either in vivo or in vitro (or ex vivo).
[0015] In another aspect of the invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising the present GLP2
gastrointestinal tissue growth promoter derivative in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. Such
composition is useful for the treatment or prevention of bowel disorders or diseases such as inflammatory bowel disease
and other gastrointestinal functions. The composition may also be used for gene therapy to induce cells to endogenously
produce the gastrointestinal tissue growth promoter peptide derivative that may then be implanted in a subject to produce
the desired biological effect. Finally, the composition may also be used for manufacturing pharmaceutical or veterinary
compositions for the enhancement of large intestine tissue growth.
[0016] In a further embodiment of the present invention, there is provided the present GLP- 2 gastrointestinal tissue
growth promoter derivative or a conjugate thereof for use in the treatment or prevention of bowel disorders or diseases
such as inflammatory bowel disease, and gastrointestinal functions in a subject, preferably a mammal, animal or human.
[0017] In a further aspect of the present invention, there is provided a conjugate comprising the present GLP- 2 gastrointestinal
tissue growth promoter derivative covalently bonded to a blood component.
[0018] A method is described for extending the in vivo half-life of a GLP-2 gastrointestinal tissue growth promoter in
a subject, the method comprising covalently bonding the GLP- 2 gastrointestinal tissue growth promoter derivative to a
blood component. The covalent bonding may take place in vivo or in vitro.
[0019] The gastrointestinal tissue growth promoter compounds are peptides which are GLP- 2 analogs which possesses
gastrointestinal tissue growth promoting activity. Details of the sequences of these analogs are illustrated below.
[0020] A further use of the present compound derivative may be the determination of the intestinotrophic activity of a
hormone when used in combination with the present compound derivative, and particularly when the compound is a
GLP- 2 analog or a GLP- 2 fragment. Such method comprises the steps of: (a) coadministering the hormone with an
intestinotrophic amount of the GLP- 2 derivative to a test subject; (2) assessing the subsequent growth of small and large
intestine tissue in the test subject; and (3) determining whether the growth of small and/or large intestine tissue in the
test subject is enhanced relative to control subjects treated with unmodified GLP- 2 analog or GLP- 2 derivative.
[0021] If a linking group is present, it is 2-[2-(2- amino) ethoxy] ethoxy acetic acid, AEEA.
IN THE DRAWINGS
[0022]
EP 1 360 202 B1
4
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Figure 1 illustrates the changes in small intestine wet weight in mice treated with saline or 5 Pg of the compounds
of Examples 1-8 twice daily, for 10 days (n = 10/group). Results are expressed as mean delta weight vs. control
SEM.
Figure 2 illustrates changes in small intestine and large intestine wet weight in mice treated with saline or 5, 25 or
50 Pg of the compounds of Examples 5, 7 and 8, twice daily, for 10 days (n =10/group). Results are expressed as
mean weight SEM.
Figure 3 illustrates the mean plasma concentrations for the compounds of Examples 5 and 8 in Sprague- Dawley
rats following a single 500 nmol/kg intravenous or subcutaneous dose (n = 4 / group).
Figure 4 illustrates detection of the compound of Example 8 conjugated to rat plasma proteins using a polyclonal
antibody anti- GLP- 2 antibody and comparison to the pattern obtained with an anti- rat albumin.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0023] In vivo bioconjugation is the process of covalently bonding a molecule, such as the present gastrointestinal
tissue growth promoter compound derivative, within the body, to target blood components, preferably proteins, in a
manner that permits the substantial retention, or increase in some instances, of the biological activity of the original
unmodified GLP- 2 gastrointestinal tissue growth promoter peptide therein, while providing an extended duration of the
biological activity though giving the GLP- 2 derivative the biophysical parameters of the target blood component,
[0024] For the purposes of the present invention, the terms "analog" or "fragment" are meant to include amino acid
sequences comprising peptides with different amino acid sequences from the native sequence, such as the GLP- 2
sequence, but with similar or comparable activity. Such analogs preferably have an amino acid sequence at least 60%,
and more preferably at least 80%, and most preferably at least 95% the same as that of either GLP- 2 or a fragment of
GLP- 2 having the same number of amino acid residues.
[0025] The present gastrointestinal tissue growth promoter peptide derivative comprise a GLP- 2 gastrointestinal tissue
growth promoter peptide that has been modified by coupling thereto a reactive entity, either directly or via a linking group,
the reactive entity being capable of forming a covalent bond with a blood component, preferably blood proteins. The
reactive entity is stable in an aqueous environment, and is MPA. The covalent bond is formed between the reactive
entity and a thiol group on the blood component. The preferred blood component comprises mobile blood components
like serum albumin, immunoglobulins, or combinations thereof. In a most preferred embodiment, the blood component
is serum albumin.
[0026] The blood components are preferably mobile, which means that they do not have a fixed situs for any extended
period of time, generally not exceeding 5 minutes, and more usually one minute. These blood components are not
membrane- associated and are present in the blood for extended periods of time in a minimum concentration of at least
0.1 Pg/mL Preferred mobile blood components include serum albumin, transferrin, ferritin and immunoglobulins such
as IgM and IgG. The half- life of mobile blood components is at least about 12 hours.
[0027] The present gastrointestinal tissue growth promoter derivative is a GLP- 2 peptide, and therefore protective
groups may be required during the synthesis process of the GLP- 2 derivative. These protective groups are conventional
in the field of peptide synthesis, and can be generically described as chemical moieties capable of protecting the peptide
derivative from reacting with other functional groups. Various protective groups are available commercially, and examples
thereof can be found in US 5,493,007 which is hereby incorporated by reference. Typical examples of suitable protective
groups include acetyl, fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC), t- butyloxycarbonyl (BOC), benzyloxycarbonyl (CBZ), etc.
Table 1 provides both the three letter and one letter abbreviations for amino acids.
TABLE 1
NATURAL AMINO ACIDS AND THEIR ABBREVIATIONS
Name 3- letter abbreviation 1- letter abbreviation
Alanine Ala A
Arginine Arg R
Asparagine Asn N
Aspartic acid Asp D
Cysteine Cys C
Glutamic acid Glu E
Glutamine Gln Q
EP 1 360 202 B1
5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
[0028] The GLP- 2 derivative forms a peptidase- stabilized peptide after conjugation to a blood component, an albumin.
It is also contemplated that one or more additional amino acids may be added or substituted to the peptide prior to
addition of the reactive entity, to facilitate the coupling thereof to the peptide. Such addition or substitution may be made
at the N- terminal, the C- terminal, or therebetween. The thus obtained peptide derivative may be administered to a
subject, animal or human, such that conjugation with blood components occurs in vivo, or they may be first conjugated
to blood components of the subject, animal or human, in vitro, and the resulting conjugate, or peptidase-stabilized peptide
as defined below, administered to the subject
[0029] Any amino acid, present, substituted with or added to, the GLP- 2 sequence, may be D- amino acids or L- amino
acids or combinations thereof. L- amino acids are generally preferred. The derivatives of the present invention have a
glycine substitution at position 2 of the native GLP- 2 sequence because it confers to the analog a greater resistance to
DPP- IV enzyme.
[0030] A peptidase- stabilized GLP- 2 derivative is more stable in the presence of peptidases in vivo than the corre-
sponding non- stabilized GLP- 2 analog. The peptidase stability is determined by comparing the half- life of the native
GLP- 2 analog in serum or blood to the half- life of the corresponding derivative containing the reactive entity in serum
or blood. Half- life is determined by sampling the serum or blood after administration of the derivative and the non- modified
peptide, and determining the activity of each compound.
[0031] In greater details, the present invention is directed to the modification of GLP- 2 and analogs and fragments
thereof to improve its bioavailability, extend in vivo half-life and distribution through selective conjugation onto a blood
component while substanitally maintaining or improving their remarkable therapeutic properties.
[0032] Human GLP- 2 is known to have the following sequence:
His- Ala- Asp- Gly- Ser- Phe- Ser- Asp- Glu- Met- Asn- Thr- Ile- Leu- Asp- Asn- Leu- Ala- Ala- Arg- Asp- Phe- Ile- Asn- Trp- Leu-
Ile- Gln- Tbr- Lys- Ile- Thr- Asp.
[0033] The invention relates to therapeutic and related uses of GLP- 2 derivatives having an extended half- life in vivo,
particularly to
- promote the growth of small and/or large intestine tissue;
- elevate blood levels of GLP- 2 derivative;
- restore or maintain gastrointestinal function;
- promote the healing and regrowth of injured or ulcerated/ inflamed intestinal mucosa;
- reduce the risk of enteric disease;
- enhance the nutritional status;
(continued)
NATURAL AMINO ACIDS AND THEIR ABBREVIATIONS
Name 3- letter abbreviation 1- letter abbreviation
Glycine Gly G
Histidine His H
Isoleucine Ile I
Leucine Leu L
Lysine Lys K
Methionine Met M
Phenylalanine Phe - F
Proline Pro P
Serine Ser S
Threonine Thr T
Tryptophan Trp W
Tyrosine Tyr Y
Valine Val V
EP 1 360 202 B1
6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
- treat or prevent nutritional or gastrointestinal disorders or diseases;
- reduce weight loss;
- reduce interleukin- 1 expression;
- increase colon length, both mucosal area and integrity in the colon, and crypt depth;
- promote villous growth in subjects suffering from a disease such as celiac disease, post- infectious villous atrophy
and short gut syndromes;
- promote proliferation of the small and large intestine in a healthy subject, for example to enable increased absorption
of nutrients in cattle allowing earlier weaning or increased milk and meat production; etc.
[0034] The effect on growth elicited by the present GLP- 2 derivatives manifests as an increase in small bowel weight,
relative to a mock- treated control. In particular, the present GLP- 2 derivatives are considered to have "intestinotrophic"
activity if, when assessed in the murine model exemplified herein, the analog mediates an increase in small bowel weight
of at least 10% relative to a control animal receiving vehicle alone. Particularly suitable for therapeutic use are those
derivatives which mediate an increase of at least 20% in small bowel weight, while those more preferred mediate an
increase in small bowel weight of 50% or more. Intestinotrophic activity is noted most significantly in relation to the
jejunum, including the distal jejunum and particularly the proximal jejunum, and is also noted in the ileum.
[0035] In addition to exhibiting intestinotrophic activity, the present GLP- 2 derivatives incorporate an amino acid substitution
within a GLP- 2 peptide "backbone", which is a variant of a mammalian GLP- 2 species in which the C- terminus
has been altered by addition of a basic residue. Thus, the present peptide derivatives incorporate a lysine residue added
at the C- terminal of the GLP- 2 peptide sequence.
[0036] The functionality on the protein will be a thiol group and the reactive entity will be the maleimido- containing
group, maleimidopropionic acid (MPA), or 2-[2-(2- amino) ethoxy)] ethoxy acetic acid (AEEA)-MPA.
[0037] Maleimide groups are most selective for sulfhydryl groups on peptides when the pH of the reaction mixture is
kept between 6.5 and 7.4. At pH 7.0, the rate of reaction of maleimido groups with sulfhydryls is 1000- fold faster than
with amines. A stable thioether linkage between the maleimido group and the sulfhydryl is formed which cannot be
cleaved under physiological conditions.
[0038] The gastrointestinal tissue growth promoter derivatives of the invention provide for specific labeling of blood
components. Such specific labeling, particularly with a maleimide, offers several advantages. Free thiol groups are less
abundant in vivo than amino groups, and as a result, maleimide derivatives covalently bond to fewer proteins. For
example, in serum albumin, there is only one free thiol group per molecule. Thus, a GLP- 2 - maleimide - albumin conjugate
will tend to comprise a 1: 1 molar ratio of peptide to albumin. In addition to albumin, IgG molecules (class II) also have
free thiols. Since IgG molecules and serum albumin make up the majority of soluble proteins in the blood, i.e., 99%,
they also make up the majority of the free thiol groups available to covalently bond to a maleimide- substituted GLP- 2.
[0039] Further, even among free thiol- containing blood proteins, specific labeling with a maleimide leads to the preferential
formation of peptide maleimide- albumin conjugates, - due to the unique characteristics of albumin itself. The
single free thiol group of albumin, highly conserved among species, is located at amino acid residue Cys 34 . It has been
demonstrated recently that the Cys 34
of albumin has an increased reactivity relative to free thiols on other free thiolcontaining
proteins. This is due in part to the unusual pK value of 5.5 for the Cys 34
of albumin. This is much lower than
typical pK values for cysteines residues in general, which are typically about 8. Due to this low pK, under normal
physiological conditions, Cys 34
of albumin is predominantly in the anionic form, which dramatically increases its reactivity.
In addition to the low pK value of Cys 34 , another factor which enhances the reactivity of Cys 34
is its location, which is in
a hydrophobic pocket close to the surface of one loop of region V of albumin. This location makes Cys 34
accessible to
ligands of all kinds, and is an important factor in Cys 34
biological role as free radical trap and free thiol scavenger. As a
result, the reaction rate acceleration can be as much as 1000- fold relative to rates of reaction of peptide- maleimides
with other free- thiol containing proteins.
[0040] Another advantage of peptide- maleimide- albumin conjugates is the reproducibility associated with the 1: 1
loading of peptide to albumin specifically at Cys 34 . Conventional activation techniques, such as with glutaraldehyde,
DCC, EDC and other chemical activators of, for example, free amines, lack this selectivity. For example, albumin contains
52 lysine residues, 25-30 of which are located on the surface of albumin and accessible for conjugation. Activating these
lysine residues, or alternatively modifying a peptide to couple through these lysine residues, results in a heterogeneous
population of conjugates. Even if an equimolar ratio peptide: albumin (i.e., 1: 1) is employed, the end result is the production
of random conjugation products, some containing an indefinite number of peptides linked to each molecule of albumin,
and each conjugate having peptides randomly coupled at any one of the 25-30 available lysine sites. Consequently,
characterization of the exact composition is virtually impossible, not to mention the absence of reproducibility. Additionally,
while it would seem that conjugation through lysine residues of albumin would at least have the advantage of delivering
more therapeutic agent per albumin molecule, studies have shown that a 1: 1 ratio of therapeutic agent to albumin is
preferred. In an article by Stehle, et al. in Anti- Cancer Drugs, 1997, 8, 677-685, it is reported that a 1: 1 ratio of the anticancer
methotrexate to albumin conjugated via glutaraldehyde gave the most promising results. These conjugates were
EP 1 360 202 B1
7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
taken up by tumor cells, whereas conjugates bearing 5: 1 to 20: 1 methotrexate molecules had altered HPLC profiles and
were quickly taken up by the liver in vivo. It would therefore seems that at higher ratios, the effectiveness of albumin as
a carrier for a therapeutic agent is diminished.
[0041] Through controlled administration of the present GLP- 2 peptide derivative, and particularly a GLP- 2 peptide
comprising a maleimide reactive entity, specific in vivo labeling or bonding of albumin and IgG can be controlled. In
typical administrations, it has been shown that 80-90% of the administered peptide derivative bonds to albumin and less
than 5% bonds to IgG. Trace bonding of free thiols present, such as glutathione, also occurs. Such specific bonding is
preferred for in vivo use as it permits an accurate calculation of the estimated half-life of the therapeutic agent administered.
[0042] Maleimide- substituted GLP- 2 peptides are generally quite stable in the presence of aqueous solutions and in
the presence of free amines. Because maleimide- substituted GLP- 2 peptides react with free thiols, protective groups
are not necessary to prevent them from reacting with themselves.
[0043] As stated above, the desired conjugates of GLP- 2 derivatives to blood components may be prepared in vivo
by administration of the derivatives directly to the subject, which may be an animal or a human. The administration may
be done in the form of a bolus, or introduced slowly over time by infusion using metered flow or the like.
[0044] Alternately, the conjugate may also be prepared ex vivo by combining blood or commercially available purified
blood components with the present GLP- 2 derivative, allowing covalent bonding of the GLP- 2 derivative to the functionalities
on blood components, and then returning or administering the conjugated blood or conjugated purified blood
component to the host. Moreover, the above may also be accomplished by first purifying an individual blood component
or limited number of components, such as red blood cells, immunoglobulins, serum albumin, or the like, and combining
the component or components ex vivo with the present compound derivative. The labeled blood or blood component
may then be returned to the subject to provide in vivo the therapeutically effective conjugates. The blood also may be
treated to prevent coagulation during handling ex vivo.
Peptide Synthesis
[0045] GLP- 2 peptides may be synthesized by standard methods of solid phase peptide chemistry well known to any
one of ordinary skill in the art. For example, the peptide may be synthesized by solid phase chemistry techniques following
the procedures described by Steward et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Company,
Rockford, Ill., (1984.) using a Rainin PTI Symphony™ synthesizer. Similarly, peptides fragments may be synthesized
and subsequently combined or linked together to form a larger peptide (segment condensation). These synthetic peptide
fragments can also be made with amino acid substitutions and/or deletion at specific locations.
[0046] For solid phase peptide synthesis, a summary of the many techniques may be found in Stewart et al. in "Solid
Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 and Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides,
1973, 2 46. For classical solution synthesis, see for example Schroder et al. in "The Peptides", volume 1, Acacemic
Press (New York). In general, such method comprises the sequential addition of one or more amino acids or suitably
protected amino acids to a growing peptide chain on a polymer. Normally, either the amino or carboxyl group of the first
amino acid is protected by a suitable protecting group. The protected and/or derivatized amino acid is then either attached
to an inert solid support or utilized in solution by adding the next amino acid in the sequence having the complimentary
(amino or carboxyl) group suitably protected and under conditions suitable for forming the amide linkage. The protecting
group is then removed from this newly added amino acid residue and the next amino acid (suitably protected) is added,
and so forth.
[0047] After all the desired amino acids have been linked in the proper sequence, any remaining protecting groups
(and any solid support) are cleaved sequentially or concurrently to afford the final peptide. By simple modification of this
general procedure, it is possible to add more than one amino acid at a time to a growing chain, for example, by coupling
(under conditions which do not racemize chiral centers) a protected tripeptide with a properly protected dipeptide to
form, after deprotection, a pentapeptide (segment condensation).
[0048] A particularly preferred method of preparing the present GLP- 2 derivatives involves solid phase peptide synthesis
wherein the amino acid a- N- terminal is protected by an acid or base sensitive group. Such protecting groups
should have the properties of being stable to the conditions of peptide linkage formation while being readily removable
without destruction of the growing peptide chain or racemization of any of the chiral centers contained therein. Examples
of N- protecting groups and carboxy- protecting groups are disclosed in Greene, "Protective Groups In Organic Synthesis,"
(John Wiley
Translation - Italian PEPTIDE GLUCAGONE-SIMILE 2 (GLP-2) DI LUNGA DURATA PER IL TRATTAMENTO DI MALATTIE E DISORDINI GASTROINTESTINALI
Descrizione
CAMPO DELL'INVENZIONE
Questa invenzione riguarda derivati del peptide glucagone-simile 2 (GLP-2). In particolare, questa invenzione riguarda derivati del peptide GLP-2 aventi un’emivita in vivo prolungata, per il trattamento o la prevenzione di disordini e malattie gastrointestinali, come la malattia infiammatoria delle viscere e altre funzioni gastrointestinali, per qualsiasi segmento del tratto gastrointestinale, dall'esofago all'ano.
SFONDO DELL'INVENZIONE
GLP-2 è un peptide di 33 amminoacidi espresso in modo tessuto-specifico dal gene pleiotropico proglucagone, e quindi appartenente alla super-famiglia di ormoni peptidici del glucagone. Un’elaborazione post-traduzionale alternativa del proglucagone avviene nel pancreas, intestino e cervello. Scissioni enzimatiche del proglucagone producono numerosi ormoni peptidici multifunzionali, implicati nel metabolismo dei nutrienti. Gli ormoni bioattivi principali derivati proglucagone sono nelle cellule α pancreatiche, e GLP-1 e GLP-2 nelle cellule L intestinali e nel cervello. Per primi Drucker et al hanno scoperto che il proglucagone possiede potenti proprietà intestinotropiche. (vedere Proc. Natl. Acad. Sci., 1996. 93, (115), 7911-7916). GLP-2, in quando peptide naturale di derivazione intestinale, è stato dimostrato avere una significativa attività riparativa nei confronti dell’epitelio mucoso dell’intestino tenue e crasso. È stato inoltre dimostrato incrementare la capacità dell’intestino di digerire e assorbire nutrienti, suggerendo un potenziale ruolo terapeutico nel trattamento di insufficienza intestinale. Infatti, numerosi studi hanno ora confermato che GLP-2 riduce o previene una lesione intestinale in modelli di colite, enterite, nutrizione parenterale totale e resezione massiva nei roditori. Molto recentemente sono state riportate prove cliniche di fase 2 di GLP-2, in cui è stato dimostrato che pazienti con sindrome da intestino corto esibiscono una potenziata capacità di assorbire nutrienti enterici dopo 30 giorni di somministrazione di GLP-2, apparentemente senza effetti collaterali indesiderati.
La principale via metabolica di smaltimento di GLP-2 avviene attraverso degradazione enzimatica. È stato riportato che GLP-2 è rapidamente degradato attraverso la rimozione dei suoi due amminoacidi N-terminali da parte della dipeptidilpeptidasi-IV (DPP-IV), questo evento rappresenta una grande limitazione perché porta alla completa inattivazione del peptide. Di conseguenza, l'emivita di GLP-2 risulta essere quindi piuttosto corta, e l'attuale trattamento con GLP-2 rende necessaria l'infusione o frequenti iniezioni. La clearance renale è stata inoltre riportata per essere implicata nello smaltimento di GLP-2. L’azione principale di GLP-2 implica la stimolazione della crescita cellulare, e non è stato esaminato il meccanismo che accoppia l’attivazione di GLP-2, in modo diretto o indiretto, alla proliferazione cellulare.
È stato mostrato che analoghi peptidici di GLP-2 nativo possiedono una potenziata attività trofica nell’intestino tenue sotto forma di antagonisti del recettore di GLP-2 (vedere ad esempio US 5.990.077).
Nonostante la loro notevole utilità, uno svantaggio critico dei peptidi e analoghi di GLP-2, come sopra menzionato, consiste nelle loro brevi emivite in vivo, che sono tipicamente non superiori a 2 minuti.
La malattia infiammatoria delle viscere (IBD, inflammatory Bowel Disease) rappresenta un gruppo di disordini cronici che causano l’infiammazione e l’ulceramento dell’intestino tenue e crasso. Può anche rappresentare una minaccia per la vita e, attualmente, non è nota alcuna cura. Comunemente, IBD fa riferimento alla colite ulcerosa (UC), limitata al colon e al morbo di (CD, Crohn's disease), che può coinvolgere l’intero tratto gastrointestinale portando a un ciclo cronico di remissioni e infiammazioni. Sono noti molti prodotti farmaceutici nel trattamento di IBD, ad esempio per sopprimere l’infiammazione, prevenire irritazioni, controllare sintomi come il dolore o la diarrea oppure sostituire o integrare nutrienti essenziali che sono scarsamente assorbiti a causa di una malattia avanzata o di un intervento chirurgico. Attuali opzioni di trattamento comprendono un'ampia varietà di prodotti farmaceutici quali amminosalicilati, corticosteroidi, immunomodulatori e agenti anti-TNF-α, e sono concepiti per ridurre l’infiammazione e alleviare i sintomi, oltre alla sostituzione di fluidi e nutrienti persi. La maggior parte di questi prodotti trovano un uso limitato in IBD considerati i loro effetti collaterali indesiderabili sul corpo in generale.
Circa un milione di persone vengono trattate per IBD ogni anno negli Stati Uniti e in Europa, la maggior parte della quali affette da morbo di Crohn o colite ulcerosa. Infatti, è comune per i soggetti affetti da IBD di essere sottoposti a un radicale intervento chirurgico implicante la rimozione di parti importanti dell'intestino. I costi sanitari diretti annuali di IBD sono circa 700 milioni dollari, e l’impatto economico totale, sia dei costi diretti che di quelli indiretti, si avvicinano ai 2-3 miliardi di dollari all’anno in tutto il mondo. I trattamenti esistenti, se da una parte forniscono un sollievo, presentano alcuni inconvenienti.
US 5.789.379 descrive analoghi di GLP-2, tra cui è stato sviluppato un analogo come composto di lunga durata (ALX-600™) che è attualmente in fase di prove cliniche. Comunque, anche se la degradazione mediata da DPP-IV di GLP-2 sembra essere in un certo modo evitata, la sua emivita rimane limitata dalla clearance renale, e non supera i 2 minuti, come sopra riportato.
Un anticorpo chimerico (Remicade™) è stato sviluppato per legarsi specificamente al fattore di necrosi tumorale alfa umano (TNF-α) per il trattamento a breve termine del morbo di Crohn. L’anticorpo è indicato per la riduzione dei sintomi di un morbo di Crohn, da moderato a severo, in pazienti che hanno avuto una inadeguata risposta alla terapia convenzionale con corticosteroidi, altri immunosoppressivi e/o antibiotici. Tuttavia con tale trattamento si sono osservati seri effetti collaterali. È stato ad esempio associato con reazioni di ipersensibilità, serie infezioni, sepsi inclusa, come pure infezioni fatali. La sua somministrazione potrebbe inoltre predisporre i pazienti ad infezioni ascrivibili al blocco di TNF.
Con una prevalenza di IBD, in aumento negli ultimi anni, sarebbe pertanto altamente desiderabile sviluppare derivati o analoghi del peptide GLP-2 in grado di mantenere sostanzialmente lo stesso livello di attività, bassa tossicità e vantaggi terapeutici di GLP-2, tuttavia con una emivita in vivo maggiore, evitando quindi la necessità di una sua continua somministrazione nel trattamento di varie malattie come malattia infiammatoria delle viscere, morbo di Crohn e colite ulcerosa, che rappresentano la due principali malattie infiammatorie delle viscere.
WO 00/69900 descrive una protezione di peptidi terapeutici endogeni da un’attività peptidasica attraverso la coniugazione a componenti ematici.
RIEPILOGO DELL'INVENZIONE
Secondo la presente invenzione, è ora fornito un derivato del promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2, avente un'emivita in vivo prolungata rispetto al corrispondente promotore di crescita gastrointestinale GLP-2 non modificato. La presente invenzione fornisce un derivato di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale, selezionato dal gruppo costituito da:
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(MPA)-CONH2; e His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Lys(AEEA-MPA)-CONH2
dove MPA è acido maleimmidopropionico ed AEEA è acido 2-[2-(2-ammino)etossi]etossi acetico. Il derivato di GLP-2 comprende un'entità reattiva (MPA) ad esso accoppiata e in grado di reagire con funzionalità disponibili su un componente ematico, sia in vivo che ex vivo, formando un legame covalente stabile. Il legame covalente formato tra il derivato di GLP-2 e il componente ematico impedisce il taglio indesiderabile di GLP-2 da parte di enzimi come la dipeptidilpeptidasi IV, prolungando così la sua emivita e la sua attività in vivo.
Componenti ematici preferiti comprendono proteine come immunoglobuline, tra cui IgG e IgM, albumina di siero, ferritina, proteine leganti gli steroidi, transferrina, proteina legante la tiroxina, α-2-macroglobulina, aptoglobina, ecc., essendo maggiormente preferite albumina di siero e IgG, ed essendo preferita in assoluto l'albumina di siero.
L'entità reattiva, l'acido maleimmidopropionico (MPA), è in grado di formare un legame covalente con il componente ematico, reagendo con i gruppi tiolo presenti su tale componente, sia in vivo che in vitro (o ex vivo).
In un altro aspetto dell'invenzione, è fornita una composizione farmaceutica comprendente il presente derivato del promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2, in combinazione con un trasportatore farmaceuticamente accettabile. Tale composizione è utile nel trattamento o nella prevenzione di disordini e malattie delle viscere, come la malattia infiammatoria delle viscere e altre funzioni gastrointestinali. La composizione può anche essere usata per una terapia genica che include cellule che producono, per via endogena, il derivato del peptide di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale, che può essere quindi impiantata in un soggetto allo scopo di produrre il desiderato effetto biologico. La composizione può anche infine essere usata per produrre composizioni farmaceutiche o veterinarie per il potenziamento della crescita tissutale dell’intestino crasso.
In un’altra forma esecutiva della presente invenzione, è fornito il presente derivato di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2, o un suo coniugato, da usare nel trattamento o prevenzione di malattie intestinali o malattie come la malattia infiammatoria delle viscere, e funzioni gastrointestinali in un soggetto, preferibilmente un mammifero, animale o essere umano.
In un altro aspetto della presente invenzione, è fornito un coniugato comprendente il presente derivato di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2 legato in modo covalente a un componente ematico.
È descritto un metodo per estendere l’emivita in vivo di un promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2 in un soggetto, il metodo comprendente il passaggio di legare in modo covalente il derivato di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2 a un componente ematico. Il legame covalente può avvenire in vivo o in vitro.
I composti promotori di crescita del tessuto gastrointestinale sono peptidi, che sono analoghi di GLP-2, che possiedono attività di promozione della crescita del tessuto gastrointestinale. Dettagli delle sequenze di questi analoghi sono illustrati a seguire.
Un altro uso del presente derivato di composto può essere la determinazione dell’attività intestinotrofica di un ormone quando usato in combinazione con il presente derivato di composto e, in particolare, quando il composto è un analogo di GLP-2 o un frammento di GLP-2. Tale metodo comprende i passaggi di: (a) cosomministrare l’ormone con una quantità intestinotrofica del derivato GLP-2 a un soggetto di prova; (2) valutare la seguente crescita di tessuto dell’intestino tenue o crasso nel soggetto di prova; e (3) determinare se la crescita dell’intestino tenue e/o crasso nel soggetto di prova viene potenziata, rispetto a soggetti di controllo trattati con un analogo di GLP-2 o un derivato di GLP-2 non modificato.
Se è presente un gruppo legante, esso è acido 2-[2-(2-ammino)etossi]etossi acetico, AEEA.
NEI DISEGNI
La figura 1 illustra le variazioni di peso umido dell’intestino tenue in topi trattati con soluzione salina o 5 µg dei composti degli esempi 1-8, due volte al giorno per 10 giorni (n = 10/gruppo). I risultati sono espressi come media della variazione del peso rispetto al controllo ± SEM.
La figura 2 illustra variazioni di peso umido dell’intestino tenue e dell’intestino crasso in topi trattati con soluzione salina o 5, 25 o 50 µg g dei composti degli esempi 5, 7 e 8, due volte al giorno per 10 giorni (n = 10/gruppo). I risultati sono espressi come peso medio ± SEM.
La figura 3 illustra le concentrazioni plasmatiche medie per i composti degli esempi 5 e 8 in ratti Sprague-Dawley dopo una singola dose intravenosa o una singola dose sottocutanea di 500 nmoli/kg (n = 4 / gruppo).
La figura 4 illustra il rilevamento del composto dell’esempio 8 coniugato a proteine plasmatiche di ratto con l’uso di un anticorpo policlonale, anticorpo anti-GLP-2, e un confronto con il modello ottenuto con un anticorpo anti-albumina di ratto.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
La bioconiugazione in vivo è il processo attraverso il quale una molecola, come il presente derivato di composto promotore di crescita del tessuto gastrointestinale, si lega in modo covalente all’interno del corpo a componenti ematici bersaglio, preferibilmente proteine, in una maniera tale da permettere una sostanziale conservazione o, i alcune circostanze, un sostanziale aumento dell'attività biologica del peptide di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2 originale, fornendo al contempo una durata estesa dell’attività biologica conferendo al derivato di GLP-2 i parametri biofisici del componente ematico bersaglio.
Per gli scopi della presente invenzione i termini "analogo" o "frammento" sono intesi per comprende sequenze di amminoacidi, tra cui peptidi, con sequenze di amminoacidi differenti dalla sequenza nativa, come la sequenza di GLP-2, che siano tuttavia dotati di un’attività simile o paragonabile. Tali analoghi hanno preferibilmente una sequenza di amminoacidi almeno 60% e più preferibilmente almeno 80%, e con preferenza assoluta almeno 95% uguale a quella di GLP-2 o di un frammento di GLP-2 avente lo stesso numero di residui di amminoacido.
Il presente derivato del peptide promotore di crescita del tessuto gastrointestinale comprende un peptide di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale GLP-2, che è stato modificato accoppiandolo con un'entità reattiva, in modo diretto o tramite un gruppo legante, l’entità reattiva essendo in grado di formare un legame covalente con un componente ematico, preferibilmente proteine ematiche. L’entità reattiva è stabile in un ambiente acquoso, ed è MPA. Il legame covalente è formato tra l’entità reattiva e un gruppo tiolo sul componente ematico. Il componente ematico preferito comprende componenti ematici mobili, quali albumina di siero, immunoglobuline o loro combinazioni. In una forma esecutiva preferita, il componente ematico è albumina di siero.
I componenti ematici sono preferibilmente mobili, il che intende che non possiedono un sito fisso per qualsivoglia periodo di tempo prolungato, in genere non superiore ai 5 minuti, e più usualmente un minuto. Questi componenti ematici non sono associati alla membrana e sono presenti nel sangue per periodi prolungati di tempo in una concentrazione minima di almeno 0,1 µg/mL. Componenti ematici mobili preferiti comprendono albumina di siero, transferrina, ferritina e immunoglobuline, come IgM e IgG. L’emivita dei componenti ematici mobili è almeno 12 ore circa.
Il presente derivato di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale è un peptide GLP-2, e suoi gruppi protettivi possono essere richiesti durante il processo di sintesi del derivato di GLP-2. Nel campo tali gruppi protettivi sono di uso convenzionale e possono essere generalmente descritti come porzioni chimiche in grado di proteggere il derivato peptidico dalla reazione con altri gruppi funzionali. Vari gruppi protettivi sono reperibili in commercio, e loro esempi possono essere ritrovati in US 5.493.007, che è incorporato in questa sede tramite rimando. Esempi tipici di gruppi protettivi adatti comprendono acetile, fluorenilmetilossicarbonile (FMOC), t-butilossicarbonile (BOC), benzilossicarbonile (CBZ), ecc. La tabella 1 fornisce le abbreviazioni per gli amminoacidi sia a tre lettere che a una lettera.
TABELLA 1
AMMINOACIDI NATURALI E LORO ABBREVIAZIONI
Nome
Abbreviazione a 3 lettere
Abbreviazione a 1 lettera
Alanina
Ala
A
Arginina
Arg
R
Asparagina
Asn
N
Acido aspartico
Asp
D
Cisteina
Cys
C
Acido glutammico
Glu
E
Glutammina
Gln
Q
Glicina
Gly
G
Istidina
His
H
Isoleucina
Ile
I
Leucina
Leu
L
Lisina
Lys
K
Metionina
Met
M
Fenilalanina
Phe
F
Prolina
Pro
P
Serina
Ser
S
Treonina
Thr
T
Triptofano
Trp
W
Tirosina
Tyr
Y
Valina
Val
V
Il derivato di GLP-2 forma un peptide stabile alle peptidasi dopo coniugazione ad un componente ematico, vale a dire un’albumina. È inoltre contemplato che uno o più amminoacidi possono essere aggiunti o sostituiti nel peptide prima dell’aggiunta dell’entità reattiva, facilitando il suo accoppiamento al peptide. Tale aggiunta o sostituzione può essere condotta all'N-terminale, il C-terminale, o tra i due estremi. Il derivato peptidico, così ottenuto, può essere somministrato a un soggetto, animale o essere umano, in modo tale che la coniugazione con i componenti ematici avvenga in vivo, oppure esso può essere prima coniugato ai componenti ematici del soggetto, animale o essere umano, in vitro, e il risultante coniugato o peptide stabilizzato alle peptidasi, come definito a seguire, può essere somministrato al soggetto.
Qualsiasi amminoacido, presente, sostituito o aggiunto alla sequenza di GLP-2, possono essere D-amminaocidi o L-amminoacidi, oppure loro combinazioni. In genere si preferiscono gli L-amminoacidi. I derivati della presente invenzione hanno una sostituzione di glicina nella posizione 2 della sequenza nativa di GLP-2, poiché conferisce all’analogo una maggiore resistenza all’enzima DPP-IV.
Un derivato di GLP-2 stabilizzato alle peptidasi è più stabile in presenza di peptidasi in vivo rispetto al corrispondente analogo di GLP-2 non stabilizzato. La stabilità alle peptidasi è determinata confrontando l'emivita dell’analogo di GLP-2 nativo, in siero o sangue, con l’emivita del corrispondente derivato contenente l’entità reattiva in siero o sangue. L’emivita viene determinata campionando il siero o sangue dopo somministrazione del derivato o del peptide non modificato, e determinando l'attività di ciascun composto.
In maggiore dettaglio, la presente invenzione è diretta alla modifica di GLP-2, e suoi analoghi e frammenti, potenziando la sua biodisponibilità, prolungando la sua emivita in vivo e la sua distribuzione attraverso la selettiva coniugazione a un componente ematico mantenendo al contempo in modo sostanziale o potenziando le sue rimarcabili proprietà terapeutiche.
È noto che il GLP-2 umano ha la seguente sequenza:
His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Tbr-Lys-Ile-Thr-Asp.
L’invenzione riguarda usi terapeutici, e usi correlati, di derivati di GLP-2, aventi una prolungato emivita in vivo, con particolare riferimento a
- promuove la crescita del tessuto dell’intestino tenue e/o crasso;
- aumentare i livelli ematici di un derivato di GLP-2;
- ripristinare o mantenere la funzione gastrointestinale;
- promuovere la guarigione o ricrescita di una mucosa intestinale lesionata o ulcerata/infiammata;
- ridurre il rischio di una malattia enterica;
- potenziare lo stato nutrizionale;
- trattare o prevenire disordini o malattie nutrizionali o gastrointestinali;
- ridurre la perdita di peso;
- ridurre l’espressione di interleuchina-1;
- aumento della lunghezza del colon, sia dell’area mucosa che dell’integrità del colon, e della profondità delle cripte;
- promuovere la crescita del villi nel soggetto affetto da una malattia come morbo ciliaco, atrofia dei villi post-infettiva e sindromi da intestino corto.
- promuovere la proliferazione dell’intestino tenue e crasso in un soggetto sano, consentendo ad esempio un maggiore assorbimento di nutrienti nel bestiame, che permette un precoce svezzamento o quantità maggiori di latte o della produzione di carni; ecc.
L’effetto sulla crescita suscitata dai presenti derivati di GLP-2 manifesta un aumento del peso dell'intestino tenue rispetto a un controllo trattato in modo fittizio. In particolare, si considera che i presenti derivati di GLP-2 presentano un’attività "intestinotrofica" se, quando valutati nel modello murino esemplificato in questa sede, l’analogo media un aumento del peso dell’intestino tenue di almeno 10% rispetto a un controllo animale che riceve il solo veicolo. Particolarmente adatti per l’uso terapeutico sono quei derivati che mediano un aumento di almeno 20% del peso dell’intestino tenue, mentre quelli più preferiti mediano un aumento del peso dell'intestino tenue del 50% o più. L’attività intestinotrofica si nota in maniera in assoluto più significativa in corrispondenza del digiuno, comprendente il digiuno distale e in particolare il digiuno prossimale, e si nota anche nell’ileo.
Oltre ad esibire l’attività intestinotrofica, i presenti derivati di GLP-2 incorporano una sostituzione di amminoacidi all’interno della “struttura portante” del peptide GLP-2, che è una variante di una specie di GLP-2 di mammifero, in cui il C-terminale è stato alterato mediante aggiunta di un residuo basico. I presenti derivati peptidici incorporano un residuo di lisina aggiunto al C-terminale della sequenza del peptide GLP-2.
La funzionalità presente sulla proteina sarà un gruppo tiolo e l’entità reattiva sarà un gruppo contenente maleimmido, acido maleimmidopropionico (MPA) o acido 2-[2-(2-ammino)etossi)] etossi acetico (AEEA)-MPA.
Gruppi maleimmide sono molto più selettivi per i gruppi solfidrile sui peptidi quando il pH della miscela di reazione è mantenuta tra 6,5 e 7,4. A pH 7,0, la velocità della reazione dei gruppi maleimmido con i solfidrili è di un fattore 1000 più veloce rispetto alle ammine. Si forma un legame tiotere stabile tra il gruppo maleimmido e il solfidrile che non può essere scisso sotto condizioni fisiologiche.
I derivati di promotore di crescita del tessuto gastrointestinale dell'invenzione forniscono la marcatura specifica di componenti ematici. Tale specifica marcatura, in particolar modo con una maleimmide, offre numerosi vantaggi. Gruppi tioli liberi sono meno abbondanti in vivo che i gruppi ammino e, conseguentemente, derivati di maleimmide si legano in modo covalente a meno proteine. Ad esempio, nell’albumina di siero è presente soltanto un gruppo tiolo libero in ciascuna molecola. Un coniugato GLP-2-maleimmide-albumina tenderà a comprendere un rapporto molare di 1:1 tra peptide e albumina. Oltre all’albumina, anche le molecole IgG (classe II) hanno tioli liberi. Poiché le molecole di IgG e l’albumina di siero costituiscono la maggior parte delle molecole solubili nel sangue, ovvero il 99%, essi costituiscono la maggior parte del gruppi tiolo liberi disponibili per legarsi in modo covalente a un GLP-2 sostituito con maleimmide.
Inoltre, anche tra le proteine ematiche contenenti tiolo liberi, la marcatura specifica con una maleimmide conduce alla formazione preferenziale di coniugati peptide maleimmide-albumina, - considerando le caratteristiche esclusive dell’albumina stessa. Il singolo gruppo tiolo dell'albumina, altamente conservato tra le specie, è localizzato nel residuo di amminoacido Cys34. È stato recentemente dimostrato che la Cys34 dell’albumina esibisce una maggiore reattività rispetto ai tioli liberi presenti su altre proteine contenenti tioli liberi. Questo in parte è dovuto al valore insolito di PK di 5,5 per la Cys34 dell'albumina. Tale valore è molto inferiore rispetto ai tipici valori di pK dei residui di cisteina in generale, che sono tipicamente circa 8. Grazie a questo basso pK, sotto condizioni fisiologiche la Cys34 dell’albumina è in modo predominante nella forma anionica, la quale aumenta drammaticamente la sua reattività. Oltre al basso valore di pK della Cys34, un altro fattore che potenzia la reattività della Cys34 è la sua posizione, ovvero in una tasca idrofoba prossima alla superficie di un’ansa della regione V dell’albumina. Questa posizione rende la Cys34 accessibile a ligandi di tutti i tipi, e risulta essere un importante fattore nel ruolo biologico della Cys34 in qualità di trappola per radicali liberi e smaltitore di tioli liberi. L’accelerazione della velocità di reazione può essere pertanto nell’ordine di un fattore 1000 rispetto a velocità di reazione di peptide-maleimmidi con altre proteine contenenti tioli liberi.
Un altro vantaggio dei coniugati peptide-maleimmide-albumina è la riproducibilità associata al caricamento 1:1 tra peptide e albumina, specificamente alla Cys34. Tecniche convenzionali di attivazione, come con glutaraldeide, DCC, EDC e altri attivatori chimici, ad esempio di ammine libere, non possiedono tale selettività. Ad esempio, l’albumina contiene 52 residui di lisina, di cui 25-30 sono localizzati sulla superficie dell’albumina e accessibili per la coniugazione. L’attivazione di questi residui di lisina, o alternativamente la modifica di un peptide che si accoppia attraverso questi residui di lisina, comporta una popolazione eterogenea di coniugati. Anche se si impiega un rapporto equimolare peptide:albumina (ovvero 1:1), il risultato finale è la produzione di prodotti causali di coniugazione, alcuni contenenti un numero indefinito di peptidi legati a ciascuna molecola di albumina, e ogni coniugato avente peptidi accoppiati in modo causale in corrispondenza di qualsiasi dei 25-30 siti di lisina disponibili. Quindi, una caratterizzazione dell’esatta composizione è virtualmente impossibile, per non parlare dell’assenza di riproducibilità. Inoltre, sebbene la coniugazione attraverso residui di lisina di albumina sembrerebbe avere almeno il vantaggio di distribuire una quantità maggiore di agente terapeutico per molecola di albumina, studi hanno mostrato che è preferibile un rapporto 1:1 tra agente terapeutico e albumina. In un articolo di Stehle, et al. in Anti-Cancer Drugs, 1997, 8, 677-685, è stato riportato che un rapporto di 1:1 tra antitumorale metotrexato e albumina coniugata via glutaraldeide, forniva i risultati in assoluto più promettenti. Questi coniugati venivano assunti dalle cellule tumorali, mentre i coniugati provvisti di molecole di metotrexato comprese tra 5:1 e 20:1 presentavano profili HPLC alterati, e venivano assorbiti velocemente dal fegato in vivo. Sembrerebbe quindi che in corrispondenza di rapporti maggiori, l’efficacia dell’albumina come trasportatore per un’agente terapeutico è diminuita.
Attraverso una somministrazione controllata del presente derivato peptidico di GLP-2, e in special modo un peptide GLP-2 comprendente un’entità di maleimmide, è possibile controllare la specifica marcatura in vivo o il legame all’albumina e IgG. In tipiche somministrazioni, è stato mostrato che 80-90% del derivato peptidico somministrato si lega all’albumina, e meno del 5% si lega alle IgG. Avvenivano anche tracce di legame di tioli liberi presenti, ad esempio nel glutatione. Tale legame specifico è preferibile per un uso in vivo, perché permette un calcolo preciso dell'emivita stimata dell'agente terapeutico somministrato.
In generale, i peptidi GLP-2 sostituiti con maleimmide sono abbastanza stabili in presenza di soluzioni acquose e in presenza di ammine libere. Poiché i peptidi GLP-2 sostituiti con maleimmide reagiscono con i tioli liberi, non sono necessari gruppi protettivi per impedire una reazione incrociata tra loro.
Come affermato sopra, i coniugati desiderati tra derivati di GLP-2 e componenti ematici possono essere preparati in vivo, mediante somministrazione diretta dei derivati al soggetto, che può essere un animale o una persona. La somministrazione può essere effettuata sotto forma di un bolo, o può essere introdotta lentamente nel tempo per infusione, usando un flusso dosato o similare.
In alternativa, il coniugato può anche essere preparato ex vivo, combinando del sangue o componenti ematici purificati disponibili in commercio con il presente derivato di GLP-2, permettendo il legame covalente del derivato di GLP-2 alle funzionalità sui componenti ematici, e quindi restituendo o somministrando il sangue coniugato, o il componente ematico purificato coniugato, all'ospite. Inoltre, quanto sopra può anche essere condotto prima purificando un singolo componente ematico o un numero limitato di componenti, come eritrociti, immunoglobuline, albumina di siero o similare, e combinando il componente o i componenti ex vivo con il presente composto derivato. Il sangue o componente ematico marcato possono quindi essere restituito al soggetto, così da fornire in vivo i coniugati terapeuticamente efficaci. Il sangue può anche essere trattato in modo da impedire una sua coagulazione durante la manipolazione ex vivo.
Sintesi peptidica
I peptidi GLP-2 possono essere sintetizzati attraverso metodi standard di chimica dei peptidi in fase solida, ampiamente noti a qualsiasi persona avente una conoscenza ordinaria del ramo. Il peptide può ad esempio essere sintetizzato, attraverso tecniche di chimica in fase solida, osservando le procedure descritte in Steward et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984), adoperando un sintetizzatore Rainin PTI Symphony™. In modo simile, è possibile sintetizzare frammenti peptidici, e quindi combinarli o legarli insieme per formare un peptide più grande (condensazione di segmenti). Questi frammenti peptidici sintetici possono anche essere realizzati con sostituzioni e/o delezioni di amminoacido in specifiche posizioni.
Per la sintesi di peptidi in fase solida, un riepilogo delle numerose tecniche può essere trovato in Stewart et al. in "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co. (San Francisco), 1963, e in Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, 1973, 2, 46. Per la classica sintesi in soluzione, vedere ad esempio Schroder et al. in "The Peptides", volume 1, Acacemic Press (New York). In generale, tale metodo comprende l'aggiunta sequenziale di uno o più amminoacidi, o di amminoacidi opportunamente protetti, ad una catena peptidica in crescita su un polimero. Il gruppo ammino o carbossile del primo amminoacido viene normalmente protetto con un adatto gruppo protettivo. L'amminoacido protetto e/o funzionalizzato viene quindi o fissato ad un supporto solido inerte, o utilizzato in soluzione, aggiungendo l'amminoacido successivo nella sequenza, avente il gruppo complementare (ammino o carbossile) opportunamente protetto, e sotto condizioni adatte alla formazione di un legame ammidico. Da questo residuo di amminoacido appena aggiunto viene poi rimosso il gruppo protettivo, viene aggiunto l'amminoacido successivo (opportunamente protetto), e così via.
Una volta legati tutti gli amminoacidi desiderati nella sequenza appropriata, tutti i gruppi protettivi rimanenti (e tutto il supporto solido) vengono tagliati in sequenza o simultaneamente, generando il peptide finale. Attraverso una semplice modifica a questa procedura generale, è possibile aggiungere più di un amminoacido per volta ad una catena in crescita, ad esempio accoppiando (sotto condizioni che non racemizzano i centri chirali) un tripeptide protetto con un dipeptide opportunamente protetto, così da formare, in seguito alla deprotezione, un pentapeptide (condensazione di segmenti).
Un metodo particolarmente preferito per preparare i presenti derivati di GLP-2 coinvolge una sintesi di peptidi in fase solida in cui l'amminoacido α-N-terminale viene protetto con un gruppo sensibile agli acidi o alle basi. Tali gruppi protettivi dovrebbero avere le proprietà di essere stabili alle condizioni di formazione dei legami peptidici, essendo allo stesso tempo facili da rimuovere senza distruggere la catena peptidica in crescita, o senza racemizzare alcuno dei centri chirali contenuti al suo interno. Esempi di gruppi protettivi per N e di gruppi protettivi per carbossi sono divulgati in Greene, "Protective Groups In Organic Synthesis," (John Wiley
More
Less
Experience
Years of experience: 21. Registered at ProZ.com: Nov 2007.
Free-lance translation, writing and proofreading activity in patent and scientific literature (from English to Italian, and vice versa). Use of translation programs, ie. Trados. My specialized fields are: medical, biological, botany, chemistry literature, as well as editorial publishing regarding biomedical research, both as translator and proof-reader. Also, I’m scientific freelance writer in medical advances, in English and Italian.
Keywords: proteins, chemistry, recombinant, patent, nutrizional, poetry, biochemistry, biochimica, genetics, genetica. See more.proteins, chemistry, recombinant, patent, nutrizional, poetry, biochemistry, biochimica, genetics, genetica, gene, antibody, patent, brochure, law, italian, english, editorial translation, oncogene, gene patent, Genomics, Gene Silencing, Stem Cells, cell biology education, models, games, acarology, accidence, aceology AIDS Education
AIDS Prevention
Abnormal Psychology
Academic and Research Libraries
Accelerator Physics
Accounting
Acid Precipitation
Acoustic Measurements and Instruments
Acoustics
Acquired Immune Deficiency Syndrome
Acting
Actuarial Science
Administration of Justice
Administrative Law
Adolescent Psychology
Adolescents
Adult Literacy
Adult and Continuing Education
Adults
Advanced Energy Technology
Advanced Technology
Advertising
Aerial Ecosystems
Aerodynamics
Aeronautical Engineering
Aeronautical Propulsion
Aeronautics
Aerosols
Aerospace Engineering
Aerospace Medicine
Aerothermodynamics
Aesthetics
Affective Development
Affective Psychology
Afghanistan
Africa
African Art
African History
African Languages
African Literature
African Studies
African-American History
African-American Literature
African-American Studies
Afro-Asiatic Languages
Age Groups
Aging
Agribusiness
Agricultural Chemistry
Agricultural Cooperatives
Agricultural Economics
Agricultural Ecosystems
Agricultural Education
Agricultural Engineering
Agricultural Policy
Agriculture
Agronomy
Air Conditioning Systems
Air Flow
Air Pollution
Air Quality
Aircrafts
Albania
Albanian Studies
Alcohol Education
Alcoholism and Treatment
Algebra
Algebraic Geometry
Algeria
Algorithms
All Disciplines Supported
Allergic Diseases
Allopathic Medicine
Alternative Energy
Alternative Fuels
Alzheimers Disease
Amblyopia
American Art
American Indian Languages
American Literature
American Material and Folk Culture
American Music
American Studies (United States)
American Theatre
Amorphous Materials
Amphibious Warfare
Amyotrophic Lateral Sclerosis
Analog Computers
Analytical Chemistry
Anatomical Systems
Ancient Civilization
Ancient History
Ancient Philosophy
Ancient Religions
Anemia
Anesthesiology
Angola
Animal Behavior
Animal Ecology
Animal Feeds and Nutrition
Animal Genetics
Animal Growth and Development
Animal Migration
Animal Morphology
Animal Physiology
Animal Production and Management
Animal Reproduction
Animal Research Ethics
Animal Sciences
Antarctic
Antarctic Studies
Anthropology
Antigens
Antigua and Barbuda
Antisatellite Weapons
Apiculture
Applied Linguistics
Applied Mathematics
Applied Physics
Applied Science
Approximation Theory
Aquaculture
Aquatic Biology
Aquatic Ecosystems
Arab History
Arab Studies
Arabic Literature
Archaeology
Archaeometry
Architectural Engineering
Architectural Technology
Architecture
Archives
Arctic
Arctic Studies
Area Studies
Argentina
Argentine Studies
Armenia
Arms Control
Arrhythmia
Art Conservation
Art Criticism
Art Education
Art History
Art Libraries
Art Metalworking
Art Theory
Art Therapy
Art Works Preservation
Arteriosclerosis
Arthritis
Artificial Intelligence
Artificial Languages
Artistic Styles or Periods
Arts
Arts Administration
Asia
Asian Art
Asian History
Asian Literature
Asian Studies
Asteroids
Asthma
Astrometry
Astronautics
Astronomy
Astrophysics
Atmospheric Chemistry
Atmospheric Dynamics
Atmospheric Electricity
Atmospheric Ionization
Atmospheric Measurements and Instruments
Atmospheric Optics
Atmospheric Physics
Atmospheric Radiation
Atmospheric Sciences
Atomic Physics
Atrophic Disorders
Audiology
Auditing
Australasian History
Australia
Australian Studies
Austria
Austronesian and Oceanic Languages
Autecology
Autism
Automotive Engineering
Aviation
Azerbaijan
Bacterial and Fungal Diseases
Bacteriology
Bahamas
Bahrain
Ballet
Baltic Languages
Bangladesh
Bangladeshi Studies
Barbados
Basic Skills Education
Bass
Behavioral Disorders
Behavioral Geriatrics
Behavioral Medicine
Behavioral Neuroscience
Behavioral Pediatrics
Behavioral Sciences
Behavioral Toxicology
Belarus
Belgium
Belize
Benin
Biblical Languages
Biblical Studies
Bibliographies
Bilingual Education
Biochemistry
Biodiversity
Bioelectromagnetics
Bioenergy
Bioengineering
Biogeography
Biography and Autobiography
Bioinorganic Chemistry
Biological Carcinogenesis
Biological Instrumentation
Biological Models
Biology
Bioluminescence
Biomechanics
Biomedicine
Biometrics
Bionics
Biophysics
Biopolymers
Bioprocessing
Biosensors
Biotechnology
Blood Banks
Blood Transfusion
Bolivia
Bone
Book Arts
Borneo
Bosnia-Hercegovina
Botswana
Brain
Brass Instruments
Brazil
Brazilian Studies
Breast Cancer
British History
British Studies
Broadcasting
Brunei
Buddhism
Building Materials
Building Technology
Bulgaria
Bulgarian Studies
Burkina Faso
Burns
Burundi
Business Administration
Business Education
Business Ethics
Business History
Business Law
Business or Industry
Byzantine History
Calvinism
Cambodia
Cameroon
Canada
Canadian History
Canadian Studies
Cancer
Cancer Diagnosis and Detection
Cancer Epidemiology
Cancer Etiology
Cancer Prevention and Control
Cancer Radiotherapy
Cancer Treatment
Cape Verde
Carbohydrates
Carbon
Carcinogenesis
Cardiology
Cardiomyopathies
Cardiovascular Diseases and Disorders
Cardiovascular Nursing
Cardiovascular Pharmacology
Cardiovascular System
Career Counseling
Career Education
Caribbean Region
Caribbean Studies
Cartography
Cartoons
Catalysis
Cataracts
Catholicism
Cell Biology
Cello
Cellular Pathology
Cellular Physiology
Celtic Languages
Central Africa
Central African Republic
Central African Studies
Central America
Central American Studies
Central Asia
Ceramic Arts
Ceramic Engineering
Ceramic Materials
Cerebral Palsy
Cerebrovascular Disorders
Chad
Chaos
Charity
Chemical Carcinogenesis
Chemical Engineering
Chemical Fuels
Chemical Hazards
Chemical Instrumentation
Chemical Kinetics
Chemical Mechanics
Chemical Oceanography
Chemical Physics
Chemical Propulsion
Chemical Reactions
Chemical Sensors
Chemical Separation
Chemical Synthesis
Chemical Technology
Chemical Thermodynamics
Chemical Wastes
Chemical and Biological Warfare
Chemistry
Chemistry of Elements and Compounds
Child Adoption
Child Behavior Disorders
Child Development
Child Development Disorders
Child Psychology
Children
Childrens Literature
Chile
China (Peoples Republic of)
Chinese Studies
Chiropractic
Choirs
Choreography
Choroidal Diseases
Christianity
Chromatography
Cinema Studies
Citizenship
Civic Affairs
Civil Engineering
Civil Justice System
Civil and Political Rights
Civilization
Classical Archaeology
Classical Art
Classical Civilization
Classical Languages
Classical Literature
Classical Music
Cleanup Technology
Climate Dynamics and Climate Change
Climatology
Clinical Chemistry
Clinical Dentistry
Clinical Epidemiology
Clinical Immunology
Clinical Medicine
Clinical Oncology
Clinical Pharmacology
Clinical Psychology
Cloud Physics
Clouds
Coal
Coal Combustion
Coal Gasification
Coal Liquefaction
Coal Mining
Coal Technology
Coastal Ecosystems
Coastal Geomorphology
Coastal and Harbor Engineering
Coding Theory
Cognition
Cognition Disorders
Cognitive Development
Cognitive Neurosciences
Cognitive Psychology
Colloid Chemistry
Colombia
Colombian Studies
Colonial American History
Coma
Combat Engineering
Combinatorics
Combustion
Comets
Command-Control-Communications and Intelligence
Commerce
Commonwealth Literature
Communication
Communication Development
Communication Networks
Communication Skills
Communication Systems
Communications Engineering
Communicative Disorders
Communities
Companion and Therapy Animals
Comparative Education
Comparative Literature
Comparative Physiology
Comparative Religion
Comparative and Diachronic Linguistics
Compensatory Education
Complex Variables
Complexity Theory
Composite Materials
Computation
Computational Chemistry
Computational Complexity
Computational Fluid Dynamics
Computational Physics
Computer Aided Design
Computer Aided Manufacturing
Computer Applications
Computer Architecture
Computer Art
Computer Assisted Instruction
Computer Circuits
Computer Engineering
Computer Graphics
Computer Hardware
Computer Methods
Computer Networks
Computer Peripherals
Computer Programming
Computer Science
Computer Security
Computer Simulation and Modeling
Computer Software
Computer Storage Devices
Computer Systems
Computer Technology
Computer Vision
Concrete Structures
Condensed Matter Physics
Congo
Connective Tissue
Connective Tissue Diseases
Conservation Education
Constitutional Government
Constitutional Law
Construction Engineering
Consulting Engineering
Consumer Behavior
Consumer Economics
Contemporary Music
Continuum Mechanics
Contraception
Control Systems
Control Technology
Control Theory
Convulsive Disorders
Cooperative Education
Copper
Corn
Corneal Diseases
Correctional Institutions and Procedures
Corrosion
Cosmic Radiation
Cosmology
Costa Rica
Cote D-Ivoire
Counseling and Guidance
Crafts
Craniofacial Anomalies
Creative Writing
Crime Causation
Crime Prevention
Crime Victims
Criminal Behavior
Criminal Justice
Criminal Justice Policy
Criminal Law
Criminology
Critical Patient Care
Croatia
Crop Science
Cross-Cultural Studies
Cryogenics
Cryptology
Crystallography
Cuba
Cultural Anthropology
Cultural Geography
Cultural History
Cultural Pluralism
Cultural Rights
Cultural Studies
Curatorship
Curriculum Materials
Cybernetics
Cyprus
Cystic Fibrosis
Cytogenetics
Czech Republic
Czechoslovakian Studies
DNA Sequencing
Dairy Science
Dance
Data Analysis
Data Communication
Data Processing
Databases
Deafness
Decision Science
Decorative Arts
Defense Policy
Defensive Simulation or Modeling
Dementia
Democracy
Demography
Demyelinating Diseases and Disorders
Denmark
Dental Caries
Dental Health and Hygiene
Dental Pharmacology
Dental Restorative Materials
Dental Technology
Dental and Oral Diseases and Disorders
Dentistry
Depression
Dermatitis
Dermatology
Descriptive Linguistics
Descriptive Statistics
Design Arts
Developing and Underdeveloped Countries
Developmental Biology
Developmental Genetics
Developmental Neurobiology
Developmental Psychology
Diabetes Mellitus
Diagnostic Medicine
Diarrheal Diseases
Dielectric Properties
Diet in Health and Disease
Dietetics
Digestive System
Digestive System Diseases
Digital Computers
Diplomacy
Disability Treatment or Management
Disadvantaged
Disarmament
Disaster Preparedness
Discrete Mathematics
Diseases and Disorders
Dispute Resolution and Arbitration
Distributed Computing Systems
Djibouti
Document Preservation
Dominica
Dominican Republic
Dosimetry
Drama
Drawing
Drinking Water
Dropouts
Drug Education
Drug Therapy
Drug Toxicology
Dynamic Oceanography
Early American Literature
Early Childhood Education
Earth Observation
Earth Sciences
Earthquake Engineering
Earthquakes
East Asia
East Asian Studies
East European Studies
East and Southeast Asian Languages
East-West Relations
Eastern Africa
Eastern African Studies
Eastern Europe
Eating Disorders
Ecological Relationships
Ecology
Econometrics
Economic Development
Economic Geography
Economic Geology
Economic History
Economic Policy
Economic Systems
Economics
Economics Education
Ecosystems
Ecuador
Ecuadorian Studies
Education
Education of the Blind
Education of the Deaf
Educational Administration
Educational Assessment
Educational Curriculum Studies
Educational Equity
Educational Finance
Educational Measurement
Educational Philosophy
Educational Planning
Educational Policy
Educational Psychology
Educational Systems and Institutions
Educational Technology
Educational Testing
Educational Trends
Egypt
Egyptian Studies
Eighteenth-Century American History
Eighteenth-Century History
El Salvador
Elasticity
Elderly
Electric Batteries
Electric Engineering
Electrical Energy
Electrical Networks
Electrical Properties of Substances
Electrical Propulsion
Electricity
Electro-Optics
Electrochemistry
Electromagnetic Materials
Electromagnetism
Electron Microscopy
Electronic Circuits and Technology
Electronic Equipment and Devices
Electronic Warfare
Electronics
Electronics Systems
Electronics Technology
Electrophysiology
Elementary Education
Elementary Particle Physics
Em Waves
Embryology
Emergency Treatment
Emission Control
Emotional Stress
Employee Benefits
Endocrine Diseases
Endocrine System
Endocrinology
Endodontics
Energetic Materials
Energy
Energy Conservation
Energy Consumption
Energy Conversion
Energy Development
Energy Economics
Energy Instrumentation
Energy Management
Energy Policy
Energy Production
Energy Storage
Energy Systems
Energy Technology
Energy Transfer
Engineering
Engineering Design
Engineering Education
Engineering Geology
Engineering Management
Engines
English As A Second Language
English Language
English Literature
Enology
Entomology
Environmental Assessment
Environmental Chemistry
Environmental Conservation
Environmental Design
Environmental Economics
Environmental Education
Environmental Engineering
Environmental Genetics
Environmental Health
Environmental Health Risk Assessment
Environmental Law
Environmental Management
Environmental Medicine
Environmental Monitoring
Environmental Planning
Environmental Policy
Environmental Pollution
Environmental Protection
Environmental Quality
Environmental Restoration
Environmental Safety Assessment
Environmental Sciences
Environmental Sociology
Environmental Toxicology
Enzymes
Epidemiology
Epigraphy
Epilepsy
Equations
Equatorial Guinea
Equine Medicine
Ergonomics
Estonia
Estuarine Ecology
Estuarine Ecosystems
Ethics
Ethiopia
Ethnic Art
Ethnic Minorities
Ethnic and Racial Group Studies
Ethnography
Ethnohistory
Ethnology
Ethnomusicology
Europe
European Community
European History
European Literature
European Politics
European Studies
Evolution
Exact Sciences
Exercise Physiology
Exhibit Design and Fabrication
Experimental Physics
Experimental Psychology
Expert Systems
Explosives Technology
Extraterrestrial Life
Eye Diseases
Family Behavior
Family Ecology
Family Economics
Family Planning
Family Practice Medicine
Family Relations
Family Violence and Child Abuse
Farm and Ranch Management
Fatigue and Fracture
Feminism
Fertility Regulation
Fertility and Sterility
Fertilizers
Fiber Arts
Fiber Optics
Fiction
Fiji
Film
Film Preservation
Finance
Financial Institutions
Fine Arts
Finland
Fire and Flammability
Fisheries
Fission Energy
Flight Control
Flight Dynamics
Flight Testing
Floriculture
Flow
Fluid Dynamics
Fluid Mechanics
Fluid Physics
Flute
Fluvial Geomorphology
Folk Art
Folklore
Food Chains
Food Chemistry or Analysis
Food Management
Food Packaging
Food Processing
Food Production
Food Safety
Food Service
Food Technology
Foods and Food Science
Foreign Languages Education
Foreign Literature
Foreign Policy
Forest Ecology
Forest Economics
Forest Ecosystems
Forest Fires
Forest Genetics
Forest Pest Management
Forest Resources
Forest and Tree Diseases
Forestry
Fossil Fuels
France
Free Enterprise
French History
French Language
French Literature
French Studies
Freshwater Ecosystems
Fuel Alcohols
Fuel Cells
Fuel Technology
Functional Analysis
Fusion Energy
Gabon
Gambia
Games Theory
Gangs
Gas Physics
Gas Separation
Gastroenterology
Gender Bias
Gender Studies
Genetic Engineering
Genetic Mapping
Genetics
Geochemistry
Geochronology
Geodesy
Geodetic Surveying
Geodynamics
Geographic Information Systems
Geographic Locations
Geography
Geography Education
Geology
Geomagnetism
Geomechanics
Geometry
Geomorphology
Geophysical Fluid Dynamics
Geophysics
Georgia
Geotechnology
Geothermal Energy
Geriatric Pharmacology
Geriatric Psychology
Geriatrics
German History
German Studies
Germanic Languages
Germanic Literature
Germany
Gerontology
Ghana
Gifted or Talented Education
Glaciology
Glass Art
Glaucoma
Global Environmental Change
Government
Government Regulations
Graduate Education
Grain
Grammar
Graphic Arts
Graphic Design
Gravitation
Gravitational Biology
Greece
Greek Language
Greek Literature
Greek Studies
Grenada
Ground Support Systems and Equipment
Ground Water
Group Behavior
Group Theory
Growth Factors
Guatemala
Guinea
Guinea-Bissau
Guyana
HIV
Haiti
Handicapped
Handicapped Children and Youth
Handicapped Education
Hazardous Materials
Hazardous Wastes
Health
Health Care
Health Care Administration
Health Care Delivery
Health Communications
Health Costs
Health Economics
Health Education
Health Effects of Alcohol Use
Health Effects of Tobacco
Health Facilities
Health Information Systems
Health Insurance
Health Physics
Health Policy
Health Promotion
Health Psychology
Health Services
Hearing
Heart Diseases
Heat Engineering
Heat Transfer
Heating Systems
Hematologic Diseases
Hematology
Hemophilia
Hepatitis
Hereditary Diseases
High Energy Physics
High Temperature Physics
High-Pressure Chemistry
Higher Education
Hinduism
Hispanic Studies
Histology
Historic Preservation
Historical Geography
Historical Linguistics
Historical Methodologies and Styles
Historiography
History
History of Architecture
History of Medicine
History of Philosophy
History of Religion
History of Science
History of Social Sciences
History of Technology
Holistic Medicine
Holography
Home Economics
Hormones
Horticulture
Hospitals and Clinics
Hotel and Restaurant Management
Housing
Human Anatomy
Human Ecology
Human Factors Engineering
Human Genome
Human Growth and Development
Human Pregnancy
Human Reproduction
Human Resources Management
Human Rights
Humanities
Humanities Education
Hungarian Studies
Hungary
Huntingtons Chorea
Hydraulic Engineering
Hydrodynamics
Hydrography
Hydrology
Hyperbaric Medicine
Hypersonics
Hypertension
Iceland
Icelandic Studies
Ichthyology
Image Processing
Imaging Technology
Immigration Policy
Immune System
Immunobiology
Immunochemistry
Immunogenetics
Immunologic Diseases
Immunology
Immunopathology
Immunotherapy
Implant Dentistry
Incineration
Income Security
India
Indian Studies
Indo-European Languages
Indonesia
Indonesian Studies
Indoor Air Pollution
Industrial Arts Education
Industrial Design
Industrial Economics
Industrial Engineering
Industrial Psychology
Industrial Technology
Inertial Fusion
Infants
Infectious Diseases
Information Management
Information Processing
Information Retrieval
Information Science
Information Storage
Information Storage Systems
Information Systems
Information Technology
Information Theory
Infrared Astronomy
Infrared Detectors
Infrared Photochemistry
Inorganic Chemistry
Instructional Television
Instrumental Music
Instruments
Insurance
Integrated Hardware Software Systems
Integrated Optics
Intellectual Freedom
Intellectual History
Intelligence
Interface Physics
Interior Architecture
Interior Design
Intermediate Sanctions
Internal Medicine
International Agriculture
International Economics
International Education
International Finance
International Law
International Politics
International Relations
International Security
International Studies
International Trade and Business
Interpersonal Communication
Interstellar Space
Invertebrates
Ionosphere
Iran
Iranian Studies
Iranic Languages
Iraq
Ireland (Republic of)
Irish Studies
Islam
Isotopes
Israel
Israeli Studies
Italian History
Italian Language
Italian Literature
Italian Studies
Italy
Jamaica
Japan
Japanese Language
Japanese Studies
Journalism
Judaism
Junior High School Education
Junior or Community College
Jurisprudence
Juvenile Delinquency
Kazakhstan
Kenya
Keyboard Instruments
Kidney Diseases
Kinetics
Korean Studies
Kuwait
Kyrgyzstan
Labor Economics
Labor Relations
Labor Studies
Laboratory Animal Science and Medicine
Laboratory or Test Facilities
Land Economics
Land Pollution
Land Resources
Land Use
Landfills
Landscape Architecture
Language
Language Acquisition
Language Arts Education
Laos
Laser Fusion
Laser Physics
Laser Spectroscopy
Lasers and Masers
Latin
Latin American History
Latin American Literature
Latin American Studies
Latvia
Law
Law Enforcement
Law Libraries
Lead
Leadership
Learning
Lebanon
Legal Education
Legal History
Legal Information Systems
Legal Practice and Procedure
Legislatures
Leisure Studies
Leprosy
Lesotho
Leukemia
Lexicography
Liberia
Libraries
Library Administration
Library Automation
Library Cataloging and Classification
Library Collection Development
Library Information Networks
Library Science
Library Service to Children and Youth
Library Services
Libya
Life Sciences
Lighting Design
Limnology
Linear Algebra
Linguistic Anthropology
Linguistics
Lipids
Literacy
Literary Analysis
Literary Criticism
Literary Forms and Genres
Literary Research
Literature
Lithuania
Liver Diseases
Livestock
Local and Municipal Government
Logic
Logic Design
Logic and Switching Circuits
Lunar Sciences
Lung Cancer
Lupus
Luxembourg
Lymphatic System
Lymphatic System Diseases
Macroeconomics
Madagascar
Magazines
Magnetic Fusion
Magnetic Technology
Magnetism
Magnetohydrodynamics
Magnetospheric Physics
Malawi
Malaysia
Mali
Malnutrition
Malta
Mammalogy
Man-Machine Systems
Management
Management Information Systems
Manufacturing Engineering
Manufacturing Processes
Marine Animals
Marine Biology
Marine Ecosystems
Marine Engineering
Marine Geology
Marine Geophysics
Marine Meteorology
Marine Plants
Marketing
Mars
Marshall Islands
Marxism
Mass Communication
Mass Media
Mass Spectroscopy
Materials
Materials Characterization
Materials Chemistry
Materials Engineering
Materials Processing
Materials Reliability
Materials Sciences
Materials Synthesis
Materials Technology
Materials Testing
Maternal and Child Health
Mathematical Analysis
Mathematical Economics
Mathematical Foundations
Mathematical Logic
Mathematical Optimization
Mathematical Physics
Mathematical Simulation and Models
Mathematical Statistics
Mathematics
Mathematics Education
Mauritania
Mauritius
Measurement Science
Meat Science
Mechanical Engineering
Mechanical Systems
Mechanics
Media Arts
Medical Education
Medical Ethics
Medical Instrumentation
Medical Libraries
Medical Sciences
Medical or Diagnostic Imaging
Medicinal Chemistry
Medieval Art
Medieval English Literature
Medieval History
Medieval Languages
Medieval Philosophy
Mediterranean Studies
Membrane Electrochemistry
Memory
Mens Studies
Mental Health
Mental Health Services
Mental Health of the Elderly
Mental Retardation
Mesoscale Meteorology
Metabolic Biology
Metabolism
Metallic Materials
Metallurgical Engineering
Metallurgy
Meteorites and Meteors and Meteoroids
Meteorology
Mexican Studies
Mexico
Microbial Ecology
Microbiology
Microeconomics
Microgravity Science
Micronesia (Federated States of)
Microscopy
Microsensors
Microwaves
Middle America
Middle East
Middle Eastern Studies
Middle School Education
Middle-Aged Adults
Migrant Education
Military Command and Control
Military Communications
Military History
Military Intelligence
Military Logistics
Military Medicine
Military Navigation and Guidance
Military Personnel and Training
Military Psychology
Military Sciences
Military Strategy and Tactics
Mime
Mineland Reclamation
Mineral Resources
Mineralogy
Mining Engineering
Minority Education
Minority Policy Studies
Missiles
Missing and Exploited Children
Mixed Media
Mixed-Phase Chemistry
Modern History
Modern Languages
Moldova
Molecular Biology
Molecular Chemistry
Molecular Genetics
Molecular Parasitology
Molecular Pathology
Molecular Physics
Molecular Spectroscopy
Monetary Systems
Mongolia
Morbidity and Mortality
Morocco
Mozambique
Multicultural Education
Multiple Sclerosis
Muscle
Muscular Dystrophy
Musculoskeletal Diseases and Disorders
Musculoskeletal System
Museology
Museum Administration
Museum Collection Conservation and Preservation
Museum Collection Development
Museum Operations
Museum Public Affairs
Museum Public Education
Museum Registration and Cataloging
Music
Music Education
Music History
Music Therapy
Musical Composition
Musical Conducting
Musical Instruments
Musical Theatre
Musicology
Mutagenics
Myanmar
Myasthenia Gravis
Mycology
Namibia
Nanotechnology
National Security
Native American Studies
Natural Areas Conservation
Natural Gas Technology
Natural Hazards and Disasters
Natural History
Natural Language and Speech Understanding
Natural Resources
Natural Resources Conservation
Natural Resources Management
Natural Resources Policy
Natural Sciences
Naval Architecture
Nematology
Neonatal Diseases and Congenital Defects
Nepal
Nephrology
Nervous System
Nervous System Diseases and Disorders
Netherlandic Studies
Netherlands
Neural Networks
Neuroanatomy
Neurobiology
Neurochemistry
Neuroendocrinology
Neuroengineering
Neuroimmunology
Neurology
Neuronal Activity
Neuropathology
Neuropharmacology
Neurophysiology
Neuropsychology
Neurosciences
Neurosurgery
Neurotoxicology
Neurotransmitters
New Zealand
New Zealand Studies
Newspapers
Nicaragua
Niger
Nigeria
Nineteenth-Century American History
Nineteenth-Century American Literature
Nineteenth-Century Art
Nineteenth-Century English Literature
Nineteenth-Century History
Noise Pollution
Nonfiction
Nonlinear Optical Materials
Nonlinear Optics
Nonlinear Physics
Nonprofit Sector
North America
North American Studies
North Asian Languages
North Central United States Studies
North Korea
Northeastern United States Studies
Northern Africa
Northern African Studies
Northern Irish Studies
Norway
Norwegian Studies
Nosocomial Infections
Novels
Nuclear Accelerators
Nuclear Chemistry
Nuclear Energy
Nuclear Energy Risk Assessment
Nuclear Engineering
Nuclear Fission
Nuclear Fuels
Nuclear Fusion
Nuclear Magnetic Resonance
Nuclear Materials
Nuclear Materials Transport
Nuclear Medicine
Nuclear Physics
Nuclear Power Plants
Nuclear Reactors
Nuclear Safety
Nuclear Sciences
Nuclear Weapons
Nuclear and Radioactive Hazards
Nuclear and Radioactive Wastes
Number Theory
Numerical Analysis
Numismatics
Nurse Practitioner
Nursery Stock
Nursing
Nursing Administration
Nursing Education
Nursing Homes
Nutrition
Nutrition Education
Nutrition and Metabolic Diseases
Nutritional Aspects of Disease
Nutritional Physiology
Obesity
Oboe
Obstetrics
Occupational Diseases
Occupational Medicine
Occupational Safety
Occupational Therapy
Ocean Acoustics
Ocean Engineering
Ocean Mining
Ocean Optics
Oceania
Oceanographic Instrumentation
Oceanography
Oil
Oil Shale
Olfaction
Oman
Onchocerciasis
Oncologic Nursing
Oncology
Opera
Operations Research
Ophthalmology
Opportunity Restricted to Minorities - Minority Institutions
Opportunity Restricted to Women
Opportunity for Junior Faculty
Optical Astronomy
Optical Communications
Optical Computers
Optical Engineering
Optical Measurements and Instruments
Optical Properties of Substances
Optics
Optoelectronic Devices
Optometry
Oral History
Oral Interpretation
Oral Literature
Oral Surgery
Organ
Organ Transplantation
Organic Chemistry
Organic Materials
Organizational Adaptation
Organizational Theory and Behavior
Organized Crime
Organometallic Chemistry
Oriental Languages
Ornithology
Orphan Drugs
Orthodontics
Orthopedics
Osteopathic Medicine
Otolaryngology
Pacific Islands Studies
Pain
Painting
Pakistan
Pakistani Studies
Paleobiology
Paleoclimatology
Paleoecology
Paleography
Paleolimnology
Paleomagnetism
Paleontology
Panama
Pancreatic Diseases
Papua New Guinea
Paraguay
Paraguayan Studies
Parallel Processing Systems
Paralysis
Parapsychology
Parasitic Diseases
Parasitology
Parenteral Drugs and Nutrients
Parkinsons Disease
Parks and Recreation Management
Particle Accelerators
Particle Measurements and Instruments
Particle Optics
Particle Physics
Pathobiology
Pathology
Patient Care
Pattern Recognition
Pay Equity
Peace
Pediatric Neurology
Pediatric Nursing
Pediatric Pharmacology
Pediatric Surgery
Pediatrics
Pediatrics and Nutrition
Peptides
Perception
Percussion Instruments
Performing Arts
Perinatology
Periodontal Diseases
Periodontics
Personality Development
Personality Disorders
Peru
Pest Management
Pesticides
Petrochemistry
Petroleum Engineering
Petroleum Technology
Petrology
Pharmaceutics
Pharmacokinetics
Pharmacology
Pharmacy
Pharmacy Administration
Phase Transformations
Philanthropy
Philippine Studies
Philippines
Philosophy
Philosophy of Law
Philosophy of Religion
Philosophy of Science
Phonetics
Photobiology
Photocatalysis
Photochemistry
Photoconversion
Photoelectrochemistry
Photogrammetry
Photography
Photojournalism
Photonics
Photosynthesis
Photovoltaics
Physical Acoustics
Physical Carcinogenesis
Physical Chemistry
Physical Education
Physical Geography
Physical Geology
Physical Oceanography
Physical Sciences
Physical Therapy
Physical and Biological Anthropology
Physics
Physiology
Piano
Planetary Atmospheres
Planetary Biology
Planetary Geology
Planetary Moon
Planetary Physics
Planetary Sciences
Plant Adaptation
Plant Anatomy
Plant Biology
Plant Ecology
Plant Genetics and Plant Genome
Plant Growth and Development
Plant Metabolism
Plant Molecular Biology
Plant Nutrition
Plant Pathology
Plant Physiology
Plant Sciences
Plasma
Plasma Physics
Plastic Arts
Plastic or Cosmetic Surgery
Plastics and Synthetics Technology
Plate Tectonics
Podiatry
Poetry
Poison Control
Poland
Polar Regions
Polish Studies
Political Behavior
Political Economics
Political History and Theory
Political Ideologies
Political Leadership
Political Science
Politics
Pollution Control
Polymer Chemistry
Polymer Physics
Polymers
Population Control
Population Distribution
Population Dynamics
Population Ecology
Population Genetics
Population Geography
Population Migration
Population Studies
Portugal
Portuguese Language
Portuguese Literature
Portuguese Studies
Postgraduate Education
Postsecondary Education
Poultry Science
Poverty
Poverty Programs
Power Systems
Precipitation Systems
Premenstrual Syndrome
Preschool Education
Preservation of Library Materials
Preventive Cardiology
Preventive Dentistry
Preventive Medicine
Primary Education
Primatology
Print Making
Print Media
Printing and Publishing History
Private and Parochial Education
Probability
Probes and Satellites
Production Engineering
Productivity
Professional Education
Programming Languages
Propellants
Propulsion
Propulsion Technology
Prose
Prostate Cancer
Prosthetic Devices
Prosthodontics
Protein Engineering
Proteins
Protestantism
Psoriasis
Psychiatric Nursing
Psychiatry
Psychoactive Agents
Psychoanalysis
Psychobiology
Psycholinguistics
Psychology
Psychology of Women
Psychometrics
Psychopathology
Psychopharmacology
Psychophysics
Psychosexual Behavior
Psychosexual Development
Psychosocial Development
Psychotherapy
Psychotic Disorders
Public Administration
Public Affairs
Public Education
Public Health
Public Libraries
Public Opinion
Public Policy
Public Radio and Television
Public Relations
Public Utilities Law
Pulmonary Medicine
Pulmonary Vascular Disease
Pulsed Electronic Spectroscopy
Purchasing or Procurement
Qatar
Quantum Chemistry
Quantum Electronics
Quantum Mechanics
Quantum Optics
Quantum Physics
Race Relations
Radar
Radiation
Radiation Biology
Radiation Chemistry
Radiation Effects
Radiation Measurements and Instruments
Radiation Physics
Radio Communications
Radio and Radar Astronomy
Radio and Television
Radiology
Radiopharmaceuticals
Radiotherapy
Radon
Rangeland Management
Reading
Reading Education
Real Variables
Records Management
Recreation and Sport
Recycling
Reef Ecosystems
Refractory Materials
Regional Planning
Regional Science
Regulatory Biology
Rehabilitation
Rehabilitation Engineering
Rehabilitation Psychology
Relativity
Religious Studies
Religious Systems
Remedial Education
Remote Sensing
Renaissance
Renaissance Art
Renaissance English Literature
Renewable Energy Resources
Renewable Resources
Reproductive Biochemistry
Reproductive Biology
Reproductive Physiology
Resource Development and Exploration
Respiratory System
Respiratory Tract Diseases
Restoration and Eighteen-Century English Literature
Retinal Diseases
Retirement
Reunion
Reyes Syndrome
Rheumatology
Rice
Ring Theory
Riparian Ecosystems
Robotics
Romance Languages
Romance Literature
Romania
Romanian Studies
Runaway and Homeless Youth
Rural Education
Rural Planning
Rural Poverty
Rural Sociology
Rural Studies
Russia
Russian Language
Russian Literature
Russian and Soviet History
Russian and Soviet Studies
Rwanda
Safety Engineering
Saint Kitts and Nevis
Saint Lucia
Saint Vincent and the Grenadines
Salivary Secretions
Sanitary Engineering
Satellite Communications
Saudi Arabia
Scandinavia
Scandinavian Literature
Scandinavian Studies
Schistosomiasis (Snail Fever)
Schizophrenia
School Counseling
School Libraries and Media Centers
School Organization
School and Community Relations
Science
Science Education
Science Ethics and Values
Science Journalism
Science Policy
Science Writing
Scientific Information Systems
Scleroderma
Screenplays
Sculpture
Sea Surface Waves
Secondary Education
Sediment Transport
Sedimentology
Seed Production
Seismology
Semantics
Semiconductors
Senegal
Sensors
Sensory System
Sensory System Diseases
Separation Science
Set Design
Set Theory
Seventeenth-Century History
Sewage Disposal and Handling
Sex Education
Sex Roles
Sexual Abuse and Rape
Sexual Dysfunction
Sexually Transmitted Diseases
Seychelles
Shakespeare
Short Stories
Sickle Cell Disease
Sierra Leone
Sign Language
Signal Processing and Detection
Singapore
Singing
Sino-Tibetan Languages
Skin
Skin Diseases
Slavic Languages
Slavic Literature
Sleep Disorders
Slovak Republic
Slovenia
Small Business
Snow and Ice Geophysics
Social Anthropology
Social Behavior Disorders
Social Change
Social Development
Social Geography
Social Groups
Social History
Social Justice
Social Measurement and Indicators
Social Problems
Social Psychology
Social Science Education
Social Sciences
Social Security and Welfare Law
Social Services
Social Structure
Social Welfare
Social Work
Socialization
Sociobiology
Socioeconomics
Sociolinguistics
Sociology
Sociology of Communication
Sociology of Medicine
Sociology of Religion
Sociology of Science
Software Engineering
Soil Chemistry
Soil Conservation
Soil Genesis
Soil Mechanics
Soil Physics
Soil Resources
Soil Science
Solar Energy
Solar Fuels
Solar Heating
Solar Physics
Solar Radiation
Solar System
Solar-Terrestrial Interactions
Solar-Terrestrial Physics
Solid Mechanics
Solid State Chemistry
Solid State Electronics
Solid State Physics
Solid State Technology
Solid Waste
Solution Chemistry
Somalia
Soybeans
Space Biology
Space Life Sciences
Space Missions
Space Physics
Space Propulsion and Power
Space Radiation Effects
Space Sciences
Space Systems
Space Technology
Spacecraft and Space Stations
Spain
Spanish History
Spanish Language
Spanish Literature
Spanish Studies
Special Education
Special Groups or Populations
Special Libraries
Spectroscopy
Speech Communication
Speech Education
Speech Pathology
Speech Therapy
Speleology
Spent Fuel Storage
Spinal Cord Injuries
Sports Medicine
Sri Lanka
Stars
State Government
Statistical Computing
Statistical Mechanics
Statistics
Steam Power
Steam Supply
Stellar Physics
Stochastic Processes
Storytelling
Strabismus
Strategic Planning
Stratigraphy
String Instruments
String Quartet
Structural Biology
Structural Chemistry
Structural Engineering
Structural Geology
Structural Mechanics
Submarine Diving
Submicron Electronics
Substance Abuse Prevention
Substance Abuse and Treatment
Substance Dependence
Sudan
Sudden Infant Death Syndrome
Suicide
Sun
Supercomputers
Superconducting and Magnetic Materials
Superconductivity
Surface Chemistry
Surface Physics
Surface Science
Surface Water
Surgery
Suriname
Surveillance Technology
Survey Methods
Surveying
Sustainable Agriculture
Sustainable Energy Future
Swaziland
Sweden
Swedish Studies
Swine
Switching Theory
Switzerland
Symphony Orchestra
Synchrotron Radiation
Synecology
Syntax
Synthetic Fuels
Syria
Systematic Biology
Systematic Philosophy
Systems Analysis
Systems Engineering
Systems of Medicine
Tactile Sense
Taiwan (Republic of China)
Taiwanese Studies
Tajikistan
Tanzania
Tar Sands
Task Performance and Analysis
Taxes and Taxation
Taxonomy
Teacher Education
Teaching Methods
Technology
Technology Education
Technology Management
Technology Policy
Technology Transfer
Tectonics
Teenage Pregnancy
Telecommunication
Telescopes
Teratology
Terrestrial Ecology
Terrestrial Ecosystems
Textiles and Apparel
Thailand
Thalassemia
Theatre Arts
Theology
Theoretical Chemistry
Theoretical Linguistics
Theoretical Physics
Therapeutic Recreation
Therapeutics
Thermochemistry
Thermodynamic Processes
Thermodynamics
Thin Films
Thoracic and Cardiovascular Surgery
Thrombosis
Tobacco
Togo
Topography
Topology
Tourettes Syndrome
Tourism and Travel
Toxicology
Trachoma
Traffic Engineering
Transducers
Translation
Transplantation Biology
Transportation
Transportation Engineering
Trauma
Tribology
Trinidad and Tobago
Tropical Biology
Tropical Diseases
Tropical Ecosystems
Tropical Forests
Tropical Tree Plantations
Trumpet
Tuberculosis
Tumor Biology
Tumor Immunology
Tunisia
Turf or Ornamental Grass
Turkey
Turkish Studies
Turkmenistan
Twentieth-Century American History
Twentieth-Century Art
Twentieth-Century History
Uganda
Ukraine
Ultrasonics
Ultraviolet Photochemistry
Ultraviolet Radiation
Ultraviolet Spectroscopy
Undergraduate Education
Undersea Warfare
Undersea Weapons Systems
Unemployment
United Arab Emirates
United Kingdom
United States Congress
United States Foreign Relations
United States History
United States Politics
United States Presidents
University Administration
Uralic-Altaic Language
Uranus
Urban Design
Urban Development
Urban Education
Urban Planning
Urban Poverty
Urban Sociology
Urban Studies
Urbanism
Urogenital Diseases
Urogenital System
Urology
Uruguay
Uruguayan Studies
Uzbekistan
Vaccines
Vacuum Metallurgy
Vacuum Physics
Vacuum Science
Vacuum Technology
Values Education
Vascular Diseases
Vatican City
Venezuela
Venezuelan Studies
Vertebrates
Very Large Scale Integration
Veterinary Medicine
Veterinary Pathology
Veterinary Pharmacology
Veterinary Surgery
Veterinary Toxicology
Video Art
Vietnam
Viola
Violent Crime
Violin
Viral Carcinogenesis
Viral Diseases
Virology
Vision
Visual Arts
Viticulture
Vocal Music
Vocational Education
Vocational Rehabilitation
Voice Language
Volcanology
Voluntarism
Warfare
Waste Management
Waste Reduction
Waste Water Treatment
Water Chemistry
Water Conservation
Water Policy
Water Pollution
Water Power
Water Quality
Water Resources
Water Supply
Watercolor
Wave Physics
Weapons
Weapons Effects
Weather Forecasting
Weather Modification
Weed Science
Welding
Welfare
West African Studies
West Asian Languages
West European Studies
Western Africa
Western Civilization
Western Europe
Western Samoa
Western United States Studies
Wetland Ecosystems
Wetlands Ecology
Wheat
Wild Animals
Wildlife Management
Wildlife Protection
Wind Instruments
Wind Power
Women in Literature
Women in Society
Womens History
Womens Studies
Wood Resources
Work and Employment
Writing
Writing Skills
X-Ray Astronomy
Yemen
Youth Employment
Youth Policy Studies
Yugoslavia
Zaire
Zambia
Zimbabwe
Zinc
Zoo Animals
Zoological Parks
Zoology
acology
acoustics
adenology
aedoeology
aerobiology
aerodonetics
aerodynamics
aerolithology
aerology
aeronautics
aerophilately
aerostatics
agonistics
agriology
agrobiology
agrology
agronomics
agrostology
alethiology
algedonics
algology
anaesthesiology
anaglyptics
anagraphy
anatomy
andragogy
anemology
angelology
angiology
anthropobiology
anthropology
aphnology
apiology
arachnology
archaeology
archelogy
archology
arctophily
areology
aretaics
aristology
arthrology
astacology
astheniology
astrogeology
astrology
astrometeorology
astronomy
astrophysics
astroseismology
atmology
audiology
autecology
autology
auxology
avionics
axiology
bacteriology
balneology
barodynamics
barology
batology
bibliology
bibliotics
bioecology
biology
biometrics
bionomics
botany
bromatology
brontology
bryology
cacogenics
caliology
calorifics
cambistry
campanology
carcinology
cardiology
caricology
carpology
cartography
cartophily
castrametation
catacoustics
catalactics
catechectics
cetology
chalcography
chalcotriptics
chaology
characterology
chemistry
chirocosmetics
chirography
chirology
chiropody
chorology
chrematistics
chronobiology
chrysology
ciselure
climatology
clinology
codicology
coleopterology
cometology
conchology
coprology
cosmetology
cosmology
craniology
criminology
cryobiology
cryptology
cryptozoology
ctetology
cynology
cytology
dactyliology
dactylography
dactylology
deltiology
demology
demonology
dendrochronology
dendrology
deontology
dermatoglyphics
dermatology
desmology
diabology
diagraphics
dialectology
dioptrics
diplomatics
diplomatology
docimology
dosiology
dramaturgy
dysgenics
dysteleology
ecclesiology
eccrinology
ecology
economics
edaphology
Egyptology
ekistics
electrochemistry
electrology
electrostatics
embryology
emetology
emmenology
endemiology
endocrinology
enigmatology
entomology
entozoology
enzymology
ephebiatrics
epidemiology
epileptology
epistemology
eremology
ergology
ergonomics
escapology
eschatology
ethnogeny
ethnology
ethnomethodology
ethnomusicology
ethology
ethonomics
etiology
etymology
euthenics
exobiology
floristry
fluviology
folkloristics
futurology
garbology
gastroenterology
gastronomy
gemmology
genealogy
genesiology
genethlialogy
geochemistry
geochronology
geogeny
geogony
geography
geology
geomorphogeny
geoponics
geotechnics
geratology
gerocomy
gerontology
gigantology
glaciology
glossology
glyptography
glyptology
gnomonics
gnosiology
gnotobiology
graminology
grammatology
graphemics
graphology
gromatics
gynaecology
gyrostatics
haemataulics
hagiology
halieutics
hamartiology
harmonics
hedonics
helcology
heliology
helioseismology
helminthology
hematology
heortology
hepatology
heraldry
heresiology
herpetology
hierology
hippiatrics
hippology
histology
histopathology
historiography
historiology
homiletics
hoplology
horography
horology
horticulture
hydrobiology
hydrodynamics
hydrogeology
hydrography
hydrokinetics
hydrology
hydrometeorology
hydropathy
hyetology
hygiastics
hygienics
hygiology
hygrology
hygrometry
hymnography
hymnology
hypnology
hypsography
iamatology
iatrology
iatromathematics
ichnography
ichnology
ichthyology
iconography
iconology
ideogeny
ideology
idiomology
idiopsychology
immunogenetics
immunology
immunopathology
insectology
irenology
iridology
kalology
karyology
kidology
kinematics
kinesics
kinesiology
kinetics
koniology
ktenology
kymatology
labeorphily
larithmics
laryngology
lepidopterology
leprology
lexicology
lexigraphy
lichenology
limacology
limnobiology
limnology
linguistics
lithology
liturgiology
loimology
loxodromy
magirics
magnanerie
magnetics
malacology
malariology
mammalogy
manège
Mariology
martyrology
mastology
mathematics
mazology
mechanics
meconology
melittology
mereology
mesology
metallogeny
metallography
metallurgy
metaphysics
metapolitics
metapsychology
meteoritics
meteorology
metrics
metrology
microanatomy
microbiology
microclimatology
micrology
micropalaeontology
microphytology
microscopy
mineralogy
molinology
momilogy
morphology
muscology
museology
musicology
mycology
myology
myrmecology
mythology
naology
nasology
nautics
nematology
neonatology
neossology
nephology
nephrology
neurobiology
neurology
neuropsychology
neurypnology
neutrosophy
nidology
nomology
noology
nosology
nostology
notaphily
numerology
numismatics
nymphology
obstetrics
oceanography
oceanology
odology
odontology
oenology
oikology
olfactology
ombrology
oncology
oneirology
onomasiology
onomastics
ontology
oology
ophiology
ophthalmology
optics
optology
optometry
orchidology
ornithology
orology
orthoepy
orthography
orthopterology
oryctology
osmics
osmology
osphresiology
osteology
otology
otorhinolaryngology
paedology
paedotrophy
paidonosology
palaeoanthropology
palaeobiology
palaeoclimatology
palaeolimnology
palaeolimnology
palaeontology
palaeopedology
paleobotany
paleo-osteology
palynology
papyrology
parapsychology
parasitology
paroemiology
parthenology
pataphysics
pathology
patrology
pedagogics
pedology
pelology
penology
periodontics
peristerophily
pestology
petrology
pharmacognosy
pharmacology
pharology
pharyngology
phenology
phenomenology
philately
philematology
phillumeny
philology
philosophy
phoniatrics
phonology
photobiology
phraseology
phrenology
phycology
physics
physiology
phytology
piscatology
pisteology
planetology
plutology
pneumatics
podiatry
podology
polemology
pomology
posology
potamology
praxeology
primatology
proctology
prosody
protistology
proxemics
psalligraphy
psephology
pseudology
pseudoptics
psychobiology
psychogenetics
psychognosy
psychology
psychopathology
psychophysics
pteridology
pterylology
pyretology
pyrgology
pyroballogy
pyrography
quinology
raciology
radiology
reflexology
rhabdology
rhabdology
rheology
rheumatology
rhinology
rhochrematics
runology
sarcology
satanology
scatology
schematonics
sciagraphy
scripophily
sedimentology
seismology
selenodesy
selenology
semantics
semantology
semasiology
semiology
semiotics
serology
sexology
siderography
sigillography
significs
silvics
sindonology
Sinology
sitology
sociobiology
sociology
somatology
sophiology
soteriology
spectrology
spectroscopy
speleology
spermology
sphagnology
sphragistics
sphygmology
splanchnology
spongology
stasiology
statics
stemmatology
stoichiology
stomatology
storiology
stratigraphy
stratography
stylometry
suicidology
symbology
symptomatology
synecology
synectics
syntax
syphilology
systematology
taxidermy
tectonics
tegestology
teleology
telmatology
teratology
teuthology
textology
thalassography
thanatology
thaumatology
theology
theriatrics
theriogenology
thermodynamics
thermokinematics
thermology
therology
thremmatology
threpsology
tidology
timbrology
tocology
tonetics
topology
toponymics
toreutics
toxicology
toxophily
traumatology
tribology
trichology
trophology
tsiganology
turnery
typhlology
typography
typology
ufology
uranography
uranology
urbanology
urenology
urology
venereology
vermeology
vexillology
victimology
vinology
virology
vitrics
volcanology
vulcanology
xylography
xylology
zenography
zoiatrics
zooarchaeology
zoochemistry
zoogeography
zoogeology
zoology
zoonomy
zoonosology
zoopathology
zoophysics
zoophysiology
zoophytology
zoosemiotics
zootaxy
zootechnics
zygology
zymology
zymurgy. See less.
This profile has received 3 visits in the last month, from a total of 3 visitors