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English to Italian: Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission
Source text - English Journal of Neurochemistry
Volume 87 Page 273 - October 2003
doi:10.1046/j.1471-4159.2003.02050.x
Volume 87 Issue 2
REVIEW
Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission
Yvonne Schmitz*, Marianne Benoit-Marand†, François Gonon†, David Sulzer*,‡
Abstract
The development of electrochemical recordings with small carbon-fiber electrodes has significantly advanced the understanding of the regulation of catecholamine transmission in various brain areas. Recordings in vivo or in slice preparations monitor diffusion of catecholamine following stimulated synaptic release into the surrounding tissue. This synaptic 'overflow' is defined by the amount of release, by the activity of reuptake, and by the diffusion parameters in brain tissue. Such studies have elucidated the complex regulation of catecholamine release and uptake, and how psychostimulants and anti-psychotic drugs interfere with it. Moreover, recordings with carbon-fiber electrodes from cultured neurons have provided analysis of catecholamine release and its plasticity at the quantal level.
Dopaminergic transmission is characterized by transmitter 'spill-over', i.e. dopamine (DA) released by a presynaptic terminal can diffuse beyond the synaptic cleft to reach multiple postsynaptic targets (for review see Vizi 1982; Zoli et al. 1999; Gonon et al. 2000; Nicholson 2000; Rice 2000). Accordingly, ultrastructural immunohistochemical studies have demonstrated that both DA receptors and uptake transporters are located extrasynaptically (Sesack et al. 1994; Yung et al. 1995; Nirenberg et al. 1997). Another argument supporting 'spill-over' DA neurotransmission is that carbon-fiber electrodes (Kissinger et al. 1973; Gonon et al. 1980; Ewing et al. 1983; Millar et al. 1985; Marsden et al. 1988; Kawagoe et al. 1993; Michael and Wightman 1999) detect synaptically released DA at micromolar concentration, although the diffusion distance to the electrode comprises several microns.
An important aspect of this type of 'social' synapse is the impact of presynaptic regulation on transmitter release and reuptake. If release is enhanced and/or uptake reduced, the number of postsynaptic binding targets increases. In contrast, there has been a long debate about the physiological impact of presynaptic plasticity in fast excitatory or inhibitory synapses, traditionally thought of as point-to-point (or 'private') synapses enwrapped by glial processes that prevent transmitter diffusion out of the synaptic cleft. In recent studies, the concept of physiologically relevant transmitter 'spill-over' has been extended to GABAergic and glutamatergic synapses (Kullmann and Asztely 1998; Jahr 2003), although its role and the conditions under which it may occur remain controversial.
In this review, we discuss the role of presynaptic DA transporters, autoreceptors, and heteroreceptors in the regulation of DA neurotransmission and mechanisms by which drugs of abuse and anti-psychotic drugs interfere with this regulation. We focus mostly on DAergic axon terminals, but also discuss some issues concerning somatodendritic DA release.
The DA transporter Go to: ChooseTop of pageThe DA transporter
Translation - Italian Regolazione Presinaptica della Neurotrasmissione Dopaminergica
Yvonne Schmitz, Marianne Benoit-Marand, Francois Gonon, David Sulzer
Estratto
Lo sviluppo di registrazioni elettrochimiche con piccoli elettrodi in fibra di carbonio hanno migliorato significativamente la comprensione della regolazione della trasmissione delle catecolamine nelle varie aree del cervello. Le registrazioni in vivo o in preparazioni slice monitorizzano la diffusione delle catecolamine seguendo il rilascio sinaptico stimolato nel tessuto circostante. L’”eccesso” sinaptico viene definito dalla quantità rilasciata, dall’attività del reuptake, e dai parametri di diffusione nei tessuti cerebrali. Tali studi hanno chiarito la complessa regolazione del rilascio e dell’uptake di catecolamine e di come gli psicostimolanti e i farmaci antipsicotici interferiscano con essa. Inoltre le registrazioni con gli elettrodi in fibra di carbonio effettuate su neuroni di coltura hanno fornito un’analisi del rilascio di catecolamine e della sua plasticità a livello quantico.
Parole chiave: anfetamina, cocaina, recettori D2, dopamina, trasportatore della dopamina, rilascio, uptake.
La trasmissione dopaminergica è caratterizzata dal trasmettitore “eccedente”, vale a dire, la dopamina (DA) rilasciata da un terminale presinaptico si può diffondere dietro la fessura sinaptico in modo da raggiungere degli obiettivi postsinaptici multipli (per approfondimenti si veda Vizi 1982; Zoli et al. 1999; Gonon et al. 2000; Nicholson 2000; Rice 2000). Di conseguenza, gli studi immunoistochimici ultrastrutturali hanno dimostrato che sia i recettori DA sia i trasportatori dell’ uptake sono situati extrasinapticamente (Sesack et al. 1994; Yung et al. 1995; Nirenberg et al. 1997). Un’altra argomentazione che supporta la neurotrasmissione DA è che gli elettrodi in fibra di carbonio (Kissinger et al. 1973; Gonon et al 1980; Ewing et al. 1983; Millar et al 185; Marsden et al 1988; Kawagoe et al 1993; Michael e Wightman 1999) individuano i Da rilasciati sinapticamente a concentrazione micromolare, sebbene la distanza di diffusione all’elettrodo comprenda numerosi micron.
Un aspetto importante di questo tipo di sinapsi “sociale” è l’impatto della regolazione presinaptico sul rilascio ed il trasmettitore del reuptake. Se il rilascio è accentuato e/o l’uptake ridotto, il numero di obiettivi dei legami postsinaptici aumenta. In contrapposizione, c’è stato un lungo dibattito sull’impatto fisiologico della plasticità presinaptico nelle sinapsi tradizionalmente considerate sinapsi eccitatorie o inibitorie veloci, tradizionalmente considerate sinapsi punto per punto (o ‘private’) avvolti da processi gliali che evitano la diffusione del trasmettitore al di fuori della fessura sinaptica. In studi recenti il concetto di trasmettitori “spill-over” fisiologicamente rilevanti è stato esteso alle sinapsi gabaergiche e glutaminergiche (Kullmann e Asztely 1998; Jahr 2003), sebbene il suo ruolo e le condizioni secondo le quali possono avvenire rimangano controverse.
In questo lavoro discuteremo del ruolo dei trasportatori presinaptici DA, degli autorecettori e degli eterorecettori nella regolazione della neurotrasmissione DA e dei meccanismi attraverso i quali le droghe d’abuso e i farmaci antipsicotici interferiscono con questa regolazione. Ci siamo concentrati in particolare sui terminali assonici Daergici, ma tratteremo anche alcuni risultati concernenti il rilascio DA somatodendritico.
Il trasportatore DA
Il trasportatore DA (DAT) è un membro della famiglia dei trasportatori biogenici delle amine con 12 domini (per studi recenti si veda Blakely e Baumann 2000; Torres et al 2003). Nelle regioni cerebrali innervate in modo compatto dai terminali Daergici (ad esempio lo striato dorsale, il nucleo dell’accumbens, il tubercolo olfattorio), il reuptake DA è il meccanismo più importante della disattivazione DA (Jones et al 1998b; Benoit-Marand et al 2000). Il DAT è uno degli obiettivi maggiori dei farmaci psicostimolanti, in particolare della cocaina e delle anfetamine, le quali inducono un radicale aumento nelle concentrazioni extracellulari di DA. Il DAT si localizza nei somati, nei dendriti, negli assoni, e nei terminali assonici dei neuroni dopaminergici del mesencefalo (Niremberg et al 1996). Ultrastrutturalmente l’immunotracciante DAT è presente per lo più nelle membrane plasmatiche extrasinaptiche (Niremberg et al 1997), il che supporta l’idea della trasmissione extrasinaptica. Le descrizioni quantitative della diffusione del DA nel microambiente extracellulare del cervello e la sua restrizione attraverso l’uptake sono state ottenute iniettando determinate quantità di soluzione DA in preparati di porzioni cerebrali e registrando i segnali DA a distanza dal sito di iniezione (Rice et al 1985; Nicholson 1995). Un confronto tra regioni somatodendritiche [substantia nigra (SN) e area tegmentale ventrale (VTA)] e regioni dei terminali massonici (striato) hanno rivelato che l’ampiezza e il passar del tempo dei segnali DA sono determinati principalmente dall’uptake nello striatum e tramite diffusione nell’SN e nel VTA (Cragg et al 2001).
Uptake del DA
L’uptake del DA segue la cinetica di Michaelis-Menten dove l’apparente affinità dell’uptake, Km, è una misura reciproca dell’affinità di un substrato per il sito dell’uptake, e Vmax è la velocità massimale dell’uptake. Vmax è dipendente dal numero di siti di uptake e viene diminuita dagli inibitori non competitivi dell’uptake. Km è indipendente dal numero di siti di uptake e viene aumentata dagli inibitori competitivi dell’uptake (Horn 1979). I parametri tessuto-specifici dell’uptake del DA sono stati ricavati inizialmente dalle misurazioni dell’uptake [3H]DA nelle preparazioni sinaptosomiche (per approfondimenti si veda Horn 1990), e in seguito dalle misurazioni elettrochimiche con voltammetria a elettrodo con disco rotante nelle sospensioni dei tessuti striati (McElvain e Schenk 1992; Earles e Schenk 1998). Studi recenti hanno calcolato parametri di uptake in sezioni cerebrali sia registrando la diffusione DA dai siti di immissione (Nicholson 1995; Sabeti et al. 2002), o registrando l’overflow (straripamento) di DA endogeno evocato (Wightman e Zimmerman 1990; Jones et al 1995b; Schmitz et al 2001; Schonfuss et al 2001; Wu et al 2001b).
Le stime del Km dell’uptake del DA vanno da 0,2 a 2 M. Per le preparazioni sinaptosomiche è stato calcolato un Km da M 0,2 (Near et al 1988; Ross 1991). La voltammetria a disco rotante ha fornito valori tra 0,6 e 1,2 M per le sospensioni di tessuto dello striato (McElvain e Schenk 1992; Earles e Schenk 1998), e 2 M per le linee cellulari che indicavano il DAT (Wu e Gu 1999). Gli studi che hanno utilizzato i modelli di simulazione dell’overflow di DA stimolato nello striato derivavano rispettivamente valori Km da 0,16 M (Wu et al 2001a), 0,22 M (Schonfuss et al 2001), e 0,8 M (schmitz et al 2001). Vmax espressi in M/s possono essere calcolati da una pendenza iniziale della fase discendente delle misurazioni dell’overflow del DA a condizione che il rilascio di DA evocato sia sufficientemente alto (Kawagoe et al 1992). Il picco dell’overflow di DA in risposta ad una singola stimolazione elettrica nello striato dorsale in vitro è 1 M DA, misurato con voltammetria ciclica. Ciò si traduce in un’iniziale concentrazione (immediatamente dopo il rilascio) DA di 2-4 M secondo i modelli di stimolazione che rappresentano il filtraggio del segnale prodotto tramite diffusione all’elettrodo. I valori Vmax tra 4 e 6 M/s per lo striato dorsale sono stati determinati dalla simulazione dell’overflow DA registrato in risposta alla singola stimolazione in vitro, e a stimolazione multipla in vivo (Wightman et al 1988; Wightman e Zimmerman 1990; Jones et al 1995b; Cragg et al 2000; Schmitz et al 2001; Schonfuss et al 2001; Wu et al 2001b). Vi sono variazioni regionali di Vmax nello stesso striato dorsale che possono riflettere diversi domini funzionali (Cragg et al 2002). L’uptake DA nello striato ventrale (nucleo accumbens, N. acc.) è stato valutato meno efficiente che nello striato dorsale (Stamford et al 1988b; Cass et al 1992; Suaud-Chagny et al 1995), con stime di Vmax di 2 M/s e 0,6 M/s rispettivamente nel nucleo e nel rivestimento del N. acc. (Jones et al 1996b). L’uptake DA nella corteccia prefrontale sembra essere molto basso (Garris e Wightman 1994; Sesack et al 1998) con valori Vmax attorno a 0,05 M/s e 0,5 M/s rispettivamente (Jones et al 1995b; Mundorf et al 2001). Nelle aree con bassa attività DAT, il trasportatore della norepinefrina (NET) ed il trasportatore della serotonina (SERT) potrebbero partecipare nell’uptake del DA (Yamamoto e Novotney 1998; Miner et al 2000; Cragg et al 2001; Moron et al 2002). Inoltre, la disgregazione enzimatica tramite catecol-O-metiltransferasi assume un ruolo nella clearance del DA in queste regioni cerebrali (Wayment et al 2001; Matsumoto et al 2003).
Il ruolo dell’Uptake del DA nella trasmissione DA
I neuroni DAergici producono due tipi di attività di attivazione. Nei roditori, queste corrispondono a singoli spike (potenziali a punta) ad una frequenza media sotto i 5 Hz e attiva da 2 a sei potenziali d’azione con una frequenza di intrattivazione di 15-30 Hz (Grace and Bunney 1984a,b). I singoli neuroni DAergici possono cambiare da un modello ad un altro e nei ratti non repressi il modello di attivazone è favorito in risposta a stimoli sensoriali (Freeman e Bunney 1987). Nelle scimmie, i neuroni mesoencefalici rispondono ad uno stimolo appetitivo o condizionato attraverso un singolo stimolo (Schultz et al 1997).
Grace a Bunney (1984a,b) hanno ipotizzato che ‘l’attivazione potrebbe essere tanto rilevante quanto la frequenza di innesco nell’influire sul rilascio DA’ e questa ipotesi è supportata da altri studi (Gonon e Buda 1985; Gonon 1988). Più recentemente è stato dimostrato che il meccanismo principale che favorisce l’alto livello extracellulare di DA evocato da stimolazioni che imitano l’attività di attivazione non è la facilitazione del rilascio di DA di per se, ma l’accumulo del DA rilasciato ma come risultato di un uptake di DA saturato (Chergui et al 1994). Durante l’attività tonica, il rilascio di DA attraverso singoli spike viene sgombrato prima dello spike successivo. In contrapposizione a ciò, durante l’attivazione, il DA rilasciato si accumula nello spazio extracellulare. L’accumulo è più ovvio nel nucleo accumbens e nel tubercolo olfattivo piuttosto che nello striato dorsale perché l’uptake del DA è più potente nello striato dorsale rispetto alle altre regioni (Chergui et al 1994; Suaud-Chagny et al 1995). Pertanto a causa del reuptake l’attività tonica e l’attività di attivazione risultano in differenti livelli extracellulari di DA.
Di conseguenza nei topi in cui è assente il DAT, il DA rilasciato si accumula durante l’attività tonica senza ulteriore aumento durante l’attività di attivazione (Benoit-Marand et al 2000). E’ interessante che questi topi siano iperattivi a causa del loro alto livello extacellulare basale, ma mostrano un peggioramento nell’apprendimento spaziale e ‘difficoltà nell’arrestare risposte inappropriate’ (Gainetdinov et al 1999). Questi deficit cognitivi possono verificarsi perché questi topi non riescono a tradurre l’attività di attivazione implicata nell’apprendimento in cambiamenti fasici nel DA extracellulare (Benoit-Marand et al 2000). L’accumulo extracellulare di DA prodotto dalle attivazioni è necessario per attivare significativamente gli autorecettori D2 (Benoit-Marand 2001) e per stimolare i recettori postsinaptici D1 (Chergui et al 1996; Chergui et al 1997; Gonon 1997). Tutti questi dati evidenziano l’importanza del reuptake del DA nelle espressioni differenziali delle attivazioni e le attività di rilascio dello spike singolo dei neuroni DAergici.
Infine, l’uptake del DA sembra avere un ruolo nel riempire nuovamente le riserve intracellulari di DA, in particolar modo durante il rilascio prolungato di DA (Gainetdinov et al 1998). Conformemente a questa ipotesi il rilascio di DA è maggiormente dipendente dalla sintesi del DA, e il tasso di quest’ultima è raddoppiato, nei topi carenti di DAT (Jone set al 1998b; Benoit-Marand et al 2000).
Funzioni DAT oltre l’uptake
Il DAT, in aggiunta all’uptake, produce anche correnti simili a canali di ioni in risposta a substrati quali il DA e l’anfetamina (Khoshbouei et al 2003). Nei ratti analizzati i neuroni DA, il trasporto di DA, a concentrazioni più basse del dovuto per l’attivazione dei recettori D2, stimolava una conduttanza anione che provocava una risposta eccitatoria (Ingram et al 2002). Gli autori hanno suggerito che in condizioni di basso DA extracellulare, la depolarizzazione dovuta all’attività DAT facilita il rilascio di DA. Con più alte concentrazioni extracellulari di DA questo effetto sarebbe annullato dall’attivazione degli autorecettori inibitori.
Un altro studio recente ha suggerito che il DAT possa mediare il rilascio di DA direttamente attraverso il trasporto opposto, un meccanismo che in precedenza veniva associato esclusivamente all’azione dell’anfetamina (si veda la sezione sull’anfetamina). Nelle preparazioni slice il rilascio di DA veniva prodotto dai dendriti e dai somati nel reticolato SN attraverso la stimolazione della proiezione glutamatergica dal nucleo subtalamico e veniva conclusa dagli inibitori DAT. Gli autori hanno suggerito che il trasporto inverso dipendente da stimolazione di DA possa verificarsi se i dendriti vengono depolarizzanti oltre il potenziale inverso per un Trasporto DA. Questo rilascio DA non vescicolare causerebbe la retroinibizione del neurone DA attraverso l’attivazione dell’autorecettore, determinando così la risposta di firing (Falkenburger et al 2001).
Cocaina
La prima indicazione che la cocaina potesse agire come un inibitore dell’uptake dell’amina venne da Burn e Rand, i quali suggerirono che ‘l’azione della cocaina potrebbe arrestare il rilascio della sostanza simile alla noradrenalina dalla riserva’ (Burn e Rand 1958). Uno studio successivo individuò siti di legame neuronale della [3H]cocaina (Reith et al 1980), e che i siti di legame del DAT erano connessi con l’autosomministrazione della droga (Ritz et al 1987). Gli effetti della cocaina sull’attività motoria e sui sistemi di ricompensa sono stati ben documentati. Mentre l’impedimento del reuptake del DA provocato dalla cocaina sembra una spiegazione sufficiente del suo effetto che induce la locomozione, gli effetti rinforzanti della cocaina possono implicare diversi trasportatori dell’amina (Uhl et al 2002).
Così la cocaina mantiene le sue proprietà rinvigorenti nei topi carenti di DAT (Giros et al 1996; Rocha et al 1998; Sora et al 1998), e ne innalza il livello di DA nel N. acc. (Carboni et al 2001). Questo effetto della cocaina nel DAT dei topi knockout non è mediato dal blocco del NET e del SERT nel N. acc. ed è situato con più probabilità al di fuori di questa struttura (Budygin et al 2002). Nei topi carenti sia di DAT sia di SERT, la preferenza di posto è eliminata (Sora et al 2001).
E’ stato riportato ampiamente come l’inibizione dell’uptake tramite cocaina segua una cinetica competitiva (Chen e Justice 1998; Wu et al 2001a), non competitiva, o incompetitia (McElvain e Schenk 1992; Wheeler et al 1994; Povlock e Schenk 1997). Gli studi che supportano l’inibizione competitiva una diminuzione dell’affinità apparente, con un Km che va da 2,5 M (Jones et al 1995b; Jone set al 1995a) a 11 M (Wu et al 2001a) per 10 M di cocaina. In ogni caso la cocaina non è un substrato per il DAT e non è trasportato internamente (Sonders et al 1997).
L’efficacia della cocaina dipende dal rilascio in atto del DA. I livelli accresciuti di DA extracellulare risultano dal blocco dell’uptake di cocaina, tuttavia potrebbero infine attivare gli autorecettore DA e D2 e arrestare il successivo rilascio di DA (si veda la sezione riguardante gli autorecettori D2). Analogamente, uno studio in vitro sul rilascio di DA del terminale assone ha riportato una forte risposta dell’autorecettore in presenza del blocco dell’uptake che è risultata in una riduzione del rilascio di DA nel N. acc., sebbene non nello striato dorsale (Wieczorek e Kruk 1994a). Coerentemente con questa idea, i livelli extracellulari di DA in risposta alla cocaina esaminati tramite microanalisi in vivo erano più alti nei topi a cui mancavano recettori D2 rispetto a quelli selvatici (Rouge-Pont et al 2002). Ciononostante, anche in presenza di autorecettori D2, il risultato netto dell’inibizione dell’uptake di DA indotto da cocaina è un aumento dei livelli di DA extracellulare.
Molti studi hanno sollevato il dubbio che il trattamento cronico con cocaina e astinenza alteri l’attività/espressione degli autorecettori D2 e del DAT stesso nelle diverse regioni cerebrali (per approfondimenti si veda (Kuhar e Pilotte 1996; White and Kalivas 1998; Zahniser e Doolen 2001). Mentre gli autorecettori somatodendritici D2 nel VTA diventano subsensibili durante il trattamento con cocaina (Henry et al 1989; Ackerman e White 1990; Lee et al 1997; Henry et al 1998), i risultati ottenuti dagli studi sugli autorecettori con terminali assoni sono contradditori. Un fattore importante sembra essere il regime di somministrazione della cocaina. Il trattamento intermittente con cocaina potrebbe portare a subsensibilità, e il trattamento continuo con cocaina a supersensibilità degli autorecettori D2 con terminali assoni (Yi e Jhonson 1990; Jone set al 1996a; Howard et al 1997; King et al 1999; Davidson et al 2000). In caso di assenza evolutiva dell’uptake mediato da DAT, come nel DAT dei topi knockout, l’espressione degli autorecettori D2 è ridotta a meno della metà del livello dei topi selvatici, e l’attività degli autorecettori è virtualmente assente (Jones et al 1996b).
Studi recenti indicano che il trattamento acuto con cocaina blocchi il turnover (ricambio) e la mobilizzazione del DAT cosi che più proteina DAT è espressa nella membrana plasmalemmale (Daws et al 2002; Little et al 2002). Con trattamento cronico con cocaina, la maggior parte dei risultati indicano una diminuzione nell’espressione del DAT che segue ad un periodo di astinenza sufficiente (Kuhar e Pilotte 1996), sebbene siano stati riportati sia i livelli mRNA/proteici aumentati sia quelli diminuiti (per uno studio recente si veda Kimmel et al 2003).
Anfetamina
L’anfetamina (AMPH), al contrario della cocaina, è un substrato sia per il DAT sia per l’NET ed è un inibitore competitivo dell’uptake del DA (Heikkila et al 1975; Wieczorek e Kruk 1994b; Sonders et al 1997; Jones et al 1999a; Koshbouei et al 2003). In base ai risultati di registrazioni elettrochimiche, si è calcolato che l’AMPH (10M) diminuisce l’affinità apparente del DAT da un valore Km di 0,8 a ≈ 30 M (Schmitz et al 2001). Inoltre, l’AMPH e i suoi derivati promuovono l’efflusso di DA tramite trasporto inverso attraverso i trasportatori dell’uptake della monoamina (Heikkila et al 1975; Fischer e Cho 1979; Raiteri et al 1979; Parker e Cubeddu 1986; Sulzer et al 1993; Sulzer et al 1995; Jones et al 1998a; Schmitz et al 2001). L’efflusso di DA provocato dall’AMPH attiva gli autorecettori D2 e inibisce in tal modo il rilascio di DA dipendente da stimolazione (Wieczorek e Kruk 1994b; Iravani e Kruk 1995; Schmitz et al 2001). Il rilascio vescicolare di DA è ulteriormente diminuito dall’AMPH in quanto promuove la redistribuzione di DA dalle vescicole sinaptiche al citosolo (Sulzer et al 1995; Mosharov et al 2003) facendo crollare il gradiente del pH vescicolare (Sulzer e Rayport 1990). Così l’effetto complessivo provocato dall’AMPH è una riduzione dipendente da attività del rilascio DA vescicolare, l’inibizione dell’uptake di DA, e un’induzione dell’efflusso continuo di DA tramite trasporto inverso. Gli effetti della cocaina e dell’AMPH si differenziano significativamente, in quanto la cocaina amplifica e prolunga l’attività-dipendente, i segnali DA exocitotici, laddove l’AMPH causa l’efflusso continuo di DA indipendentemente dall’attività di firing mentre si attenua ma prolunga il DA rilasciato sinapticamnete.
Il trattamento acuto con AMPH ha dimostrato di causare l’internalizzazione in entrambi gli studi in vitro e in vivo (Sauders et al 2000; Gulley et al 2002), sebbene non in tutti i sistemi (Daniels e Amara 1999). In realtà la cocaina e gli altri bloccanti dell’uptake del DA (mazindolo e nomifensina) inibivano l’internalizzazione AMPH-indotta del DAT (Saunders et al 2000) suggerendo così che gli inibitori stabilizzino l’espressione DAT nella membrana, laddove i substrati DAT come l’AMPH e il DA stesso inducono l’internalizzazione. Molto probabilmente questo processo implica le vie PKC-dipendenti (Sandoval et al 2001; Gulley et al 2002), in quanto numerosi studi hanno dimostrato che l’attivazione PKC risulta in un’internalizzazione del DAT (Copeland et al 1996; Huff et al 1997; Vaughan et al 1997; Zhang et al 1997; Zhu et al 1997; Pristupa et al 1998; Daniels and Amara 1999; Melikian e Buckley 1999). Gli effetti del trattamento cronico con AMPH sull’espressione DAT non sono caratterizzati con precisione ed i risultati, finora, non sono definitivi. Alcuni studi non hanno riportato alcun cambiamento nell’mRNA del DAT (Kula e Baldessarini 1991; Persico et al 1993; Mintz et al 1994), laddove altri studi hanno riportato un’upregulation dell’mRNA del DAT in risposta a più giorni di iniezioni di AMPH seguiti da molti giorni di astinenza (Lu e Wolf 1997; Shilling et al 1997).
Gli autorecettori DA
Il termine ‘autorecettore’ è stato coniato nel 1975 da Arvid Carlsson per gli autorecettori DA (Carlsson 1975; Starke 2001). Sebbene siano stati espressi dei dubbi sulla rilevanza fisiologica della regolazione degli autorecettori autorecettori in certi sistemi di trasmettitori (Kalsner 2001), è chiaro che gli autorecettori DA forniscono i neuroni mesoencefalici DA con un complesso sistema di retroazione (feedback) ai terminali soma e assone.
Gli autorecettori DA appartengono alla famiglia dei D2 (D2,D3,D4) dei recettori DA che sono accoppiati alle proteine inibitorie G e modulano l’attività del canale ionico e/o abbattono l’adenylyl ciclase. I recettori D2 sono espressi dai somi e dai dendriti dei neuroni SN e VTA, così come dai loro terminali assoni nello striato e nel N. acc. (Sesack et al 1994). Gli studi sui recettori D2 dei topi knockout non hanno riportato autorecettori individuabili con gli agonisti dei recettori di classe D2 per quanto concerne la regolazione della frequenza di attivazione, il rilascio di DA e la sintesi di DA. Questi risultati implicavano i recettori D2 come unici autorecettori funzionali nella famiglia D2 (Mercuriet al 1997; L’hirondel et al 1998; Benoit-Marand et al 2001; Schmitz et al 2002). Esistono tuttavia delle prove che i recettori D3 contribuirebbero alla funzione degli autorecettori. Nell’SN e nel VTA alcuni neuroni DA sembrano esprimere l’immunoreattività dei recettori D3, laddove gli assoni e i terminali assoni nel N. acc. e nello striato non hanno il tracciante D3 (Diaz et al 2000). Gli studi sulle cellule transfette hanno dimostrato che i recettori D3 possono modulare gli stessi canali ionici (attivati dalla proteina G che correggono all’interno i canali di potassio, GIRKs) come i recettori D2 (Kuzhikandathil e Oxford 1998; Kuzhikandathil e Oxford 1999, 2000) ed hanno il potenziale per influenzare il rilascio e la sintesi di DA (Tange t al 1994; O’Hara et al 1996). Ciò non è stato confermato tuttavia da uno studio recente sui neuroni mesoencefalici acutamente dissociati dai recettori D2 di topi knockout che non hanno trovato riscontro per l’attivazione mediata dai recettori D3 delle correnti GIRK (Devila et al 2003). Numerosi studi farmacologici in vivo supportano il ruolo dei recettori D3 come autorecettori (Rivet et al 1994; Aretha et al 1995; Kreiss et al 1995; Lejeune e Millan 1995; Gainetdinov et al 1996), sebbene questa evidenza sia indebolita dalla scarsa selettività degli agonisti e degli antagonisti dei recettori DA disponibili. Uno studio precedente su un gruppo di topi a cui mancavano i recettori D3 non ha riportato alterazioni nella funzione dell’autorecettore ma ha individuato invece un ruolo dei recettori D3 nel circuito che regola i livelli di DA (Koeltzov et al 1998). Al contrario uno studio recente sul recettore D3 di un altro gruppo di topi knockout ha fornito prove che i recettori D3 possano partecipare direttamente alla regolazione della secrezione di DA (Joseph et al 2002). Uno studio sui ratti trattati con l’antisenso oligodeoxynucleotidi del recettore D3 hanno suggerito un ruolo dei recettori D3 nel regolare la frequenza di attivazione (Tepper et al 1997).
Esistono poche prove che supportano il ruolo dei recettori D4 come autorecettori a parte un recente studio immunoistochimico che ha dimostrato la localizzazione presinaptica dei recettori D4 in un sottoinsieme di terminali mesoaccumbici nello shell del N. acc. (Svingos et al 2000). E’ stato riportato che gli antagonisti D4 influenzano i livelli di DA nel N. acc. in uno studio sulla microdialisi (Broderick e Piercey 1998), e nei recettori D4 dei topi knockout la sintesi del DA e il turnover sono aumentati, possibile indicazione di una funzione alterata dell’autorecettore. Data la scarsa evidenza degli autorecettori D4, gli autori dell’ultimo studio affermavano che il cambiamento osservato nel metabolismo del DA nei recettori D4 dei topi knockout potrebbe essere dovuto piuttosto agli effetti del circuito indiretto che implicano gli afferenti glutamatergici (Rubinstein et al 1997). Conformemente alla mancanza di un ruolo degli autorecettori D4, gli studi sulle linee cellulari dopaminergiche transfette hanno riportato che l’espressione dei recettori D4 non regolava il rilascio e la sintesi di DA (Tange t al 1994; O’Hara et al 1996).
In sostanza appare che la funzione degli autorecettori DA è generalmente assolta dai recettori D2, con un minore contributo putativo dei recettori D3. In studi recenti è stato suggerito che i due isoformi del recettore D2 generato da splicing alternativo, D2S e D2L, possano prestarsi a diverse funzioni pre- e postsinaptiche (Khan et al 1998). E’ stato riportato che il quinpirolo dell’agonista del recettore D2 riusciva ancora a inibire il rilascio di DA nel D2L dei topi knockout (Usiello et al 2000; Wang et al 2000). Inoltre gli effetti agonisti del recettore D2 sul potenziale della membrana erano preservati nel D2L dei topi knockout (Centonze et al 2002). Questi risultati indicano che i recettori D2L possono agire soprattutto come recettori postsinaptici e i recettori D2S come autoreccettori presinaptici. Mentre a questa ipotesi occorrerà un ulteriore supporto sperimentale, potrebbe portare potenzialmente allo sviluppo di agonisti e antagonisti specifici per i recettori D2 presinaptici contro quelli postsinaptici che potrebbero essere utili per migliorare il trattamento farmacologico dei disordini neuropsichiatrici e motori.
Frequenza di attivazione
E’ stato ben stabilito che gli autorecettori D2 modulano il potenziale della membrana dei neuroni mesoencefalici DAergici. L’attivazione dei recettori D2 produce un’iperpolarizzazione e diminuisce la frequenza di attivazione (Bunney et al 1973; Silva e Bunney 1988; Rayport et al 1992; Mercuri et al 1997) a causa dell’attivazione della conduttanza GIrk (Lacey et al 1987; Kim et al 1995; Cathala e Paupardin-Tritsch 1999). Il pattern di attivazione che i neuroni mesoencefalici DA mostrano in vivo sia con attivazione a spike singolo sia con attivazione a eccitazione (Grace e Bunney 1984a,b) dipende principalmente dagli input afferenti inibitori e eccitatori (Kitai et al 1999), i quali sono a loro volta modulati dal rilascio di DA (Paladini et al 2003). Il trattamento con antagonisti dei recettori D2 in vivo aumenta la proporzione di cellule DA attivate spontaneamente, aumenta la frequenza di attivazione e modifica il pattern da rilascio a spike singolo ad attivazione per eccitazione. La somministrazione ripetuta degli antagonisti dei recettori D2 possono portare infine ad un blocco della depolarizzazione dei neuroni DA in animali anestetizzati. Il grado in cui il blocco degli autorecettori D2 contribuiscano a queste risposte, tuttavia, non è chiaro (Bunney e Grace 1978; Grace et al 1997), e l’ipotesi che l’attivazione della depolarizzazione possa essere connessa al tipo di anestesia rimane controversa (Meli set al 1998).
Il rilascio di DA
L’attivazione degli autorecettori D2 inibisce il terminale assone (Seeman e Lee 1975; Starke et al 1978; Cubeddu e Hoffmann 1982; Gonon e Buda 1985; Dwoskin e Zahniser 1986; Mayer et al 1988; Stamford et al 1988a; May e Wightman 1989; Pali jet al 1990; Suaud-Chagny et al 1991; Kennedy et al 1992; Cragg e Greenfield 1997) e il rilascio di DA somatodendritico (Cragg e Greenfield 1997). Gli studi patch clamp sui neuroni mesoencefalici DA in vitro hanno rivelato una regolazione del recettore D2 dei canali regolati da voltaggio (Cardozo e Bean 1995), ed è stato dimostrato che il rilascio DA del terminale assone è dipendente dai canali di calcio di tipo N e P/Q (Philips e Stamford 2000). Data la dipendenza del rilascio del trasmettitore sull’influsso del calcio, la modulazione dei canali del calcio sembra essere un meccanismo ragionevole per l’inibizione del rilascio di DA mediata dal recettore D2. Questo non è stato provato drettamente, tuttavia, e uno studio recente sull’autapsi (vale a dire la sinapsi che una cellula fa con se stessa) dei neuroni mesoencefalici in coltura non ha riscontrato evidenza sulla regolazione dell’autorecettore D2 dell’influsso di calcio (Congar et al 2002). Invece gli autori hanno documentato evidenza che l’inibizione del rilascio mediato dal recettore D2 possa implicare i canali K+ sensibili all’aminopiridina-4 che agiscono a valle dall’influsso di calcio. Un lato negativo di questo studio è che le autapsi dei neuroni DA coltivati sono glutamatergiche (Sulzer et al 1998), e non è risaputo se questa scoperta possa essere ricavata dal rilascio di DA. Infine mentre anche il rilascio somatodendritico di DA è calcio dipendente (Kalivas e Duffy 1991; Rice et al 1997), in contrasto con la tipica dipendenza non lineare del rilascio sul calcio extracellulare, mostra una dipendenza lineare in concentrazioni di calcio extracellulari molto basse, che saturano circa 1 M (CHen e Rice 2001).
Mentre non c’è disaccordo sul fatto che i recettori D2 inibiscano il rilascio di DA, i risultati sul tempo di inizio e la durata dell’autonibizione del rilascio sono stati considerevolmente variabili. La durata stimata dell’autoinibizione del rilascio del terminale assone nelle diverse preparazioni va da decine di millisecondi a diversi secondi (Mayer et al 1988; Limberger et al 1991; Kennedy et al 1992; Dugast et al 1997; Benoit-Marand et al 2001; Philips et al 2002; Schmitz et al 2002). Le ragioni possibili per questa divergenza potrebbero essere spiegate con le variazioni delle condizioni in vivo e in vitro o nelle diverse specie. Un recente studio farmacologico in vitro (Philips et al 2002), e due studi sui recettori D2 dei topi knockout (Benoit-Marand et al 2001; Schmitz et al 2002) hanno ottenuto stime congruenti per il corso di tempo dell’effetto D2 sul rilascio di DA del terminale assone. In questi studi l’inizio dell’effetto D2 andava dai 50 ms ai 100 ms, l’effetto massimo tra i 300 ms e i 550 ms. La durata era di circa 800 ms nello studio in vivo e meno di 5 s nei due studi in vitro. Il corso di tempo leggermente più lungo determinato nei due studi in vitro è dovuto probabilmente ad una quantità maggiore di rilascio di DA per stimolazione nelle preparazioni a fette.
Questa distribuzione temporale dell’autoinibizione del rilascio mediato da D2 potrebbe essere adatti a ridurre o a diminuire il segnale DA in risposta ai diversi pattern di attivazione dei neuroni mesoencefalici. La frequenza basale di attivazione dei neuroni mesoencefalici nel ratto è di 4 Hz, interrotta da attivazione a eccitazione di 2-6 impulsi a 15 Hz (Grace e Bunney 1984a,b). Le registrazioni dei neuroni SN nelle scimmie hanno dimostrato che l’attivazione a eccitazione avviene in risposta alla ricompensa e dopo un periodo di apprendimento in risposta allo stimolo condizionante (Schultz et al 1997). Secondo il corso del tempo dell’autoinibizione del rilascio, il rilascio di DA è diminuito tonicamente durante l’attivazione basale, laddove si verifica meno inibizione durante l’attivazione a eccitazione (entro i primi tre spike). Inoltre, l’attivazione a eccitazione attenua transitoriamente il rilascio seguente di DA prodotto dall’attività tonica di rilascio. In questo modo l’autoinibizione di rilascio di DA potrebbe servire ad aumentare il rapporto segnale/rumore del segnale di DA in risposta all’attivazione a eccitazione ‘significativa’ contro l’attivazione di base.
Sintesi di DA
Ad eccezione degli autorecettori del terminale assone mesoprefrontale (Chiodo et al 1984; Galloway et al 1986), vi è crescente evidenza che i recettori D2 modulino la sintesi di DA diminuendo l’attività della tiroxina idroxilase (TH) (Kegr et al 1972; Roth et al 1975; Kapatos e Zigmond 1979; Haubrich e Pflueger 1982; el Mestikawy e Hamon 1986; Strait e Kuczenski 1986; Wolf et al 1986; Wolf e Roth 1990; O’Hara et al 1996). La via fondamentale implica con più probabilità l’inibizione dell’adenilil ciclase e un cambiamento cAMP dipendente nella fosforilazione di TH (Onali e Olianas 1989; Salah et al 1989; Lindgren et al 2001). Sono stati dimostrati una connessione diretta tra l’inattivazione mediata dai recettori D2 della sintesi di DA ed il rilascio ridotto di DA per le cellule PC12 ma non ancora per i neuroni. L’incubazione delle colture di cellule PC12 con gli agonisti dei recettori D2 hanno dato come risultato una sintesi di DA diminuita e frequenza e grandezza ridotte (di molecole a vescicola) del rilascio quintale (Pathos et al 1998b). Così il rilascio di DA può essere regolato dagli autorecettori D2 su due scale di tempo differenti, una veloce, che dura non più di alcuni secondi e che probabilmente coinvolge la modulazione del canale ionico, ed una lenta che può durare da alcuni minuti a ore e implica la regolazione della sintesi di DA.
Interazione con il trasportatore vescicolare
Pochi studi hanno investigato la possibilità che l’espressione del trasportatore neuronale vescicolare della monoamina (VMAT2) sia regolato, o in generale o specificamente dall’autorecettore D2. Uno studio iniziale autoradiografico non ha riportato variazioni nel tracciante VMAT2 dopo il trattamento ripetuto in vivo con sostanza dopaminergiche (Vander Borghi et al 1995). In contrapposizione a ciò due pubblicazioni recenti (Brown et al 2001; Brown et al 2002) hanno suggerito una regolazione dell’espressione di VMAT2 attraverso gli autorecettori D2. Il trattamento con cocaina aumentava l’uptake di DA nelle vescicole sinaptiche, un effetto bloccato dagli antagonisti dei recettori D2. Al contrario gli antagonisti dei recettori D2 aumentavano l’uptake di DA vescicolare (Brown et al 2001). In uno studio successivo è stata indotta una diminuzione attraverso trattamento singolo con il rilascio di DA di metanfetamina, che era anch’essa bloccata dagli antagonisti del recettore D2 (Brown et al 2002). Anche un recente studio tracciante ultrastrutturale immunogold (Nickel et al 2002) ha suggerito che i recettori D2 potrebbero regolare in principio l’espressione dendritice VMAT2, in base alla stretta associazione tra i recettori dendritici D2 e le vescicole contenenti VMAT2. Questa via presenterebbe un terzo meccanismo, in aggiunta alla regolazione della conduttanza del canale ionico e la sintesi di DA, attraverso la quale gli autorecettori D2 regolano il rilascio di DA.
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